1.4.1.1 Composición
de aminoácidos, subunidades
El análisis secuencial sólo puede realizarse Una proteína
pura. En primer lugar, la composición de aminoácidos Se determina después de la
hidrólisis ácida.
El procedimiento (separación en un único intercambio catiónico
Columna de resina y desarrollo de color Con reactivo de ninhidrina o
fluorescamina) tiene Han sido normalizados y automatizados (aminoácido Analizadores).
La figura 1.10 muestra un aminoácido típico Cromatograma ácido.
Como alternativa a estos métodos establecidos, La
derivatización de los aminoácidos con la posterior Separación y detección de
derivados Es posible (derivatización pre-columna). Varios Se pueden seleccionar
reactivos de derivatización, tales como:
• 9 - Fluorenilmetilcloroformiato(FMOC, véase 1.2.4.2.1)
• Fenilisotiocianato (PITC, véase 1.2.4.2.3)
• Dimetilaminoazobencenosulfonilcloruro (DABS-Cl, véase
1.2.4.2.1)
• Dimetilaminonaftalensulfonilcloruro (DANS-Cl, véase
1.2.4.2.1)
• 7 - Fluoro - 4 - nitrobenzo - 2 - oxa - 1,3 – diazole (NBDF,
véase 1.2.4.2.1)
• 7 - Cloro - 4 - nitrobenzo - 2 - oxa - 1,3 – diazol (NBDCl,
véase 1.2.4.2.1)
• o-ftaldialdehído (OPA, véase 1.2.4.2.4)
También es necesario conocer el peso molecular De la
proteína. Esto se determina por la columna de gel Cromatografía, ultracentrifugación o SDSPAG Electroforesis.
Además, es necesario Para determinar si la proteína es una sola Molécula o
consta de un número de moléculas idénticas o Diferentes cadenas polipeptídicas
(subunidades) asociadas A través de enlaces disulfuro o fuerzas no covalentes.
La disociación en subunidades puede lograrse Por un cambio
en el pH, por modificación química de La proteína, tal como por succinilación,
o con desnaturalización Agentes (urea, clorhidrato de guanidina, dodecil
sulfato de sodio). Los enlaces disulfuro, que También se encuentran en
proteínas que consisten Una cadena peptídica, se puede escindir por oxidación
de Cistina a ácido cisteico o por reducción a cisteína Con posterior
alquilación del grupo tiol (Véase 1.2.4.3.5) para evitar la reoxidación.
Separación De las subunidades se logra por cromatografía o Métodos
electroforéticos.
1.4.1.2 Grupos
terminales
Los aminoácidos N-terminales pueden determinarse Por
tratamiento de una proteína con l-fluoro-2,4- Dinitrobenceno (reactivo de Sanger,
véase 1.2.4.2.2) o 5 - dimetilaminonaftaleno - 1 – sulfonilo (Cloruro de
dansilo, véase 1.2.4.2.1). Otra posibilidad Es la reacción con cianato, seguida
por Eliminación del aminoácido N-terminal en el Forma de hidantoína, y
separación y recuperación Del aminoácido por escisión de la hidantoína (Véase
1.2.4.2.3). El aminoácido N - terminal (y La secuencia de aminoácidos próxima a
la N-terminal) Es accesible por hidrólisis con aminopeptidasa, En cuyo caso
debe recordarse que La tasa de hidrólisis depende del aminoácido Cadenas
laterales y que los residuos de prolina no Escindido Se requiere un
procedimiento especial El residuo N-terminal es acilado (N-formil- o N-acetilaminoácidos,
o ácido piroglutámico).
La determinación de aminoácidos C-terminales es Posible
mediante el procedimiento de hidrazinolisis Recomendado por Akabori:
El aminoácido C-terminal se separa luego de Las hidrazidas
de aminoácidos, e. G, mediante un intercambio de cationes Resina, e
identificado. Es posible marcar El aminoácido C-terminal a través de la
titulación selectiva vía oxazolinona Los aminoácidos C-terminales pueden ser
eliminados Enzimáticamente por la carboxipeptidasa A que Preferentemente
escinde los aminoácidos con aromáticos Y grandes cadenas laterales alifáticas,
carboxipeptidasa B, que cliva preferentemente la lisina, Arginina y aminoácidos
con cadenas laterales neutras O carboxipeptidasa C que escinde con menos Especificidad
pero escinde la prolina.
1.4.1.3 Hidrólisis
parcial
Las cadenas peptídicas más largas suelen estar fragmentadas.
Los fragmentos se separan y analizan Individualmente para
secuencias de aminoácidos. Selectivo Clivaje enzimático de los enlaces
peptídicos Principalmente con tripsina, que Cliva exclusivamente los enlaces Lys-X-
y Arg-X, Y quimotripsina, que escinde enlaces peptídicos Con menos especificidad
(Tyr-X, Phe-X, Trp-X y Leu - X). El ataque enzimático puede ser influenciado Por
modificación de la proteína. Por ejemplo, Acilación del grupo ε-amino de los
límites de lisina Hidrólisis tríptica a Arg-X (véase 1.4.4.1.3 Y 1.4.4.1.4),
mientras que la sustitución del grupo SH De un residuo de cisteína con un
aminoetilo Grupo introduce una nueva posición de división Para la tripsina en
la molécula "pseudolysine residuo"):
También adecuado para la hidrólisis enzimática específica De
las cadenas peptídicas es la endoproteinasa Glu-C De Staphylococcus aureus V8.
Cierra Glu- X (tampón de carbonato de amonio pH 7,8 o Tampón de acetato de
amonio pH 4,0) así como Glu - X más enlaces Asp - X (tampón fosfato pH 7,8).
El método químico más importante para la Clivaje utiliza bromuro
de cianógeno (BrCN) para Ataque Met-X-enlaces (Reacción 1.86).
La hidrólisis de proteínas con ácidos fuertes revela Una
diferencia en las tasas de hidrólisis del péptido Enlaces dependiendo del lado
de aminoácido adyacente cadena. Bonos que implican grupos amino de serina Y
treonina son particularmente susceptibles a la hidrólisis.
Este efecto se debe a N → O-acilo a través de la oxazolina y
posterior Hidrólisis de la unión éster:
La hidrólisis de proteínas con ácidos diluidos
preferentemente Rompe los enlaces aspartil-X La separación de fragmentos
peptídicos se logra mediante Gel y cromatografía en columna de intercambio
iónico Utilizando un tampón volátil como eluyente (piridina, Acetato de morfolina)
que se puede eliminar Por liofilización de las fracciones recogidas.
La separación de péptidos y proteínas por La HPLC de fase
inversa ha adquirido gran importancia, Utilizando tampones volátiles mezclados
con Disolventes orgánicos solubles en agua como fase.
La fragmentación de la proteína se realiza mediante Diferentes
técnicas enzimáticas y / o químicas, Al menos por dos enzimas de diferente
especificidad.
La disposición de los péptidos obtenidos en la Mismo orden
que ocurren en la proteína intacta Se realiza con la ayuda de la superposición Secuencias.
El principio de este método es Ilustrado para la subtilisina BPN? Como ejemplo
en Higo. 1.11.
1.4.1.4 Análisis secuencial
El método clásico es la degradación de Edman reacción.
Implica degradación escalonada de Péptidos con fenilisotiocianato (véase
1.2.4.2.3) O derivados adecuados, e. gramo. Dimetilaminoazobenceno
Isotiocianato (DABITC). Los La feniltiohidantoína resultante se identifica Directamente
o se recupera el aminoácido.
Las reacciones escalonadas se realizan en solución O en el
péptido unido a un vehículo, i. mi.
A una fase sólida. Ambos enfoques han sido Automatizada (
"secuenciador"). Los transportistas utilizados incluyen Resinas que
contienen grupos amino (por ejemplo amino Poliestireno) o perlas de vidrio
tratadas con amino alquilsiloxano:
Los péptidos se fijan entonces al soporte por Grupos carboxilo
(activación con carbodiimida O carbonildiimidazol, como en la síntesis de
péptidos) O por grupos amino. Por ejemplo, un péptido Segmento de la hidrólisis
de la proteína por La tripsina tiene lisina como su aminoácido C-terminal. Se
une al portador con p-fenilendiisotiocianato A través de la α- y ε-amino
Grupos. Tratamiento ácido suave del portador Bajo las
condiciones de la degradación de Edman se divide El primer enlace peptídico. El
procedimiento de Edman Se realiza entonces sobre el péptido acortado A través
de la segunda, tercera y posterior repetitiva reacciones:
Las microvariedades permiten trabajar en el picomole distancia.
En la cámara de reacción, la proteína Está fijado sobre un disco de fibra de
vidrio, y el acoplamiento Y se añaden reactivos de escisión y Eliminado en una
corriente de gas portador (fase vapor Secuenciación).
Aparte de la degradación de Edman, otros Métodos pueden dar
valiosa información adicional En el análisis de secuencias. Estos métodos Incluyen
la hidrólisis con amino- y carboxipeptidasas Como se menciona en el caso de Análisis
de grupo final y la fragmentación de Derivados de péptidos volátiles adecuados
en una masa espectrómetro.
1.4.1.5 Derivación de
la secuencia de aminoácidos
De la Secuencia de Nucleótidos Del gen de codificación El
número de proteínas para las que el gen codificador En el genoma se ha caracterizado
se está incrementando continuamente. Sin embargo, una parte Secuencias de aminoácidos
conocidas hoy en día Derivado de las secuencias de nucleótidos en pregunta.
Los antecedentes de este proceso serán brevemente Descrito
aquí. Los nucleótidos consisten en cuatro Diferentes bases así como
2-desoxirribosa y fosfórica ácido. Son los bloques de construcción de la Ácido
desoxirribonucleico de alto peso molecular (ADN).
Los nucleótidos están unidos mediante 2-desoxirribosa y Ácido
fosfórico como 3 \ → 5 \ beta - diésteres. En el ADN, dos Polinucleótidos están
unidos entre sí en cada Vía enlaces de puente de hidrógeno para dar una hélice.
Las bases timina y adenina, así como Citosina y guanina son complementarias
(véase Fórmula 1,90). El ADN es el portador de la genética Información que
controla la biosíntesis de proteínas Vía transcripción a mensajero ribonucleico
Ácido (ARN). En la traducción a proteínas, la Secuencia de bases codifica la
secuencia primaria de aminoácidos. Aquí, tres de las cuatro bases adenina, Guanina,
citosina y timina (abreviado AGCT) determina en cada caso un aminoácido, mi.
G., Códigos UGG para el triptófano (véase la figura 1.12).
Por lo tanto, la secuencia primaria de una proteína puede Derivar
de la secuencia de nucleótidos (base).
Para la secuenciación del ADN, el método deElección es el
proceso didesoxi (terminación de cadena Proceso) introducido por Fred Sanger En
1975. El principio se basa en las Terminación de la síntesis enzimática de una Hilo
de ADN mediante ADN polimerasa Usando un 2 \ beta, 3 \ beta -
didesoxinucleótido, i. E Prevenir la polimerización con la formación De los 3?
→ 5 \ alpha - fosfodiéster en la posición De la base en cuestión. Por ejemplo,
si la Se usa 2 \ beta, 3 \ beta - didesoxinucleótido de guanina, La biosíntesis
se detiene en guanina en cada caso. Para detectar todos los residuos de
guanina, Aproximadamente 0,5% en moles del didesoxinucleótido en Cuestión (basada
en el 2-desoxinucleótido) es usado. De esta manera, fragmentos de ADN de Se
obtienen longitudes que tienen el mismo 5 \ beta - terminal y así marcar la
posición de la base.
El material de partida es un híbrido de los singlestranded
ADN a secuenciar y un cebador Consistente en aproximadamente 20 nucleótidos.
Esto es Alargado con la ayuda de ADN polimerasa Y una mezcla de los 4
nucleótidos y una 2 \ beta, 3 \ beta - didesoxinucleótido en cada caso. el
cebador Sirve como posición de partida definida y también como Iniciador para
el inicio de la síntesis de los complementarios Cadena de ADN. Los fragmentos
de ADN de Diferentes longitudes obtenidas en cuatro experi- Separadas
electroforéticamente de acuerdo con Tamaño molecular. Para la detección, ya sea
el primer Puede ser etiquetado con cuatro fluorescentes diferentes Colorantes
(TAG) o los cuatro didesoxinucleótidos son Marcados con diferentes colorantes
fluorescentes. en el En el primer caso, se llevan a cabo 4 series de
experimentos Con cebadores etiquetados de forma diferente y uno De los 4 didesoxinucleótidos
en cada caso. Los Las cargas son combinadas y electroforéticamente Separadas
entre sí. La secuencia primaria se determina A partir de las señales medidas en
diferentes Longitudes de onda (Fig. 1.13). Cuando 4 diferente Se utilizan
dideoxinucleótidos marcados, el cebador No está etiquetado. Alternativamente,
los didesoxinucleótidos También puede ser marcado radioactivamente (Por
ejemplo, con 32P). En este caso, cuatro También se requieren síntesis.
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