lunes, 14 de noviembre de 2016
domingo, 13 de noviembre de 2016
3.6 REACCIONES QUIMICAS Y ENZIMATICAS DE INTERES PARA EL PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS
3.6.1 Prefacio
Estandarización de las propiedades de los alimentos para
satisfacer las necesidades nutricionales / Fisiológicas y toxicológicas Requisitos
de las operaciones de elaboración de Un esfuerzo perenne. La producción de
alimentos es similar A un proceso de fabricación industrial estándar: Por un
lado es el producto alimenticio con todos Sus propiedades requeridas, por otro
lado son Los componentes del producto, cada uno de los cuales Suministra una
parte distinta de las propiedades requeridas.
Tales consideraciones han llevado a En las relaciones entre
los alimentos Propiedades físicas y químicas macroscópicas Y la estructura y
reacciones a nivel molecular nivel. Una comprensión confiable de tales
relaciones Es un requisito previo fundamental para el diseño Funcionamiento de
un proceso, ya sea para optimizar Proceso o para modificar los componentes de
los alimentos Las propiedades deseadas del producto.
La modificación de las proteínas sigue estando muy lejos Siendo
un método común en la elaboración de alimentos, pero Es cada vez más reconocido
como esencial, Dos razones principales:
En primer lugar, las proteínas cumplen funciones comida.
Algunas de estas funciones se pueden servir mejor Por modificado que por
proteínas nativas.
En segundo lugar, los problemas nutricionales En todo el
mundo la utilización de nuevas materias primas Materiales.
La modificación de las reacciones puede Materias primas (por
ejemplo, proteínas de origen vegetal o microbiano Origen) cumplen con los
estrictos estándares de seguridad alimentaria, Palatabilidad y valor biológico
aceptable. Una revisión Se dará aquí de varias modificaciones de proteínas Que
se están utilizando o se están considerando para usar. Se trata de sustancias
químicas o enzimáticas Métodos o una combinación de ambos. Los ejemplos Seleccionados
para enfatizar las tendencias existentes. Mesa 1.35 presenta algunas
propiedades proteicas que Son de interés para la elaboración de alimentos.
Estas propiedades Están relacionados con la composición de aminoácidos y Secuencia
y la conformación de proteínas. Modificación De las propiedades de las
proteínas es posible Cambiando la composición de aminoácidos o la Tamaño de la
molécula o mediante la extracción o inserción de Hetero constituyentes. Tales
cambios pueden lograrse Por reacciones químicas y / o enzimáticas.
Desde el punto de vista del procesamiento de alimentos, los Modificación
de proteínas son:
• Bloqueo de las reacciones implicadas en el deterioro De
alimento (por ejemplo, la reacción de Maillard)
• Mejorar algunas propiedades físicas de las proteínas (Por
ejemplo, la textura, la estabilidad de la espuma, solubilidad)
• Mejorar el valor nutricional (aumentar la Grado de digestibilidad,
la inactivación de Otros componentes indeseables, la introducción de Ingredientes
como algunos aminoácidos).
3.6.2 Modificación
química
La Tabla 1.36 presenta una selección de reacciones químicasDe
proteínas que son pertinentes para y de corriente Importancia en la elaboración
de alimentos.
3.6.2.1 Acilación
El tratamiento con anhídrido succínico (véase 1.4.4.1.3) Generalmente
mejora la solubilidad de la proteína.
Por ejemplo, el gluten de trigo succinilado es bastante Soluble
a pH 5 (véase la figura 1.40). Este efecto es Relacionados con la desagregación
de Peso de las fracciones de gluten (véase la figura 1.41). en el Caso de la
caseína succinilada, es obvio que la Modificación cambia el punto isoeléctrico
de la (Y por lo tanto el mínimo de solubilidad) a Un pH más bajo (véase la
figura 1.42). Succinilación de la hoja Proteínas mejora la solubilidad, así
como la Sabor y propiedades emulsionantes.
La proteína de levadura succinilada tiene no sólo un aumento
Solubilidad en el rango de pH de 4-6, pero Es también más estable al calor por
encima del pH 5. Tiene mejor Propiedades emulsionantes, superando muchas otras (Tabla
1.37), y ha aumentado la capacidad de hincharse.
La introducción de grupos aminoacil en la proteína puede Ser
alcanzado por reacciones que implican aminoácidos Carboxi anhídridos (figura
1.44), aminoácidos y Carbodiimidas (figura 1.46) o por BOC-aminoácido Hidroxisuccinimidas
con posterior remoción Del grupo aminoprotector (BOC) (véase 1.161): Pruebas de
alimentación con caseína con metionina unida, Tal como se produce por el método
anterior, Han demostrado una disponibilidad satisfactoria De metionina (Tabla
1.38). Tales covalentes Unión de aminoácidos esenciales a una proteína Puede
evitar los problemas asociados con los alimentos Suplementación con aminoácidos
libres: pérdidas en Procesamiento, desarrollo de aromas no deseados A metional,
etc.
La Tabla 1.39, usando la β-caseína como ejemplo, muestra En
qué medida la asociación de una proteína se ve afectada Por su acilación con
ácidos grasos de Longitudes de cadena.
1.4.6.2.2 Alquilación
Modificación de la proteína por metilación reductora De grupos amino con
formaldehído / NaBH _ {4} Retarda las reacciones de Maillard.
El metilo resultante Derivado, dependiendo del grado de
sustitución, Es menos accesible a la proteolisis (Fig. 1.47).
Por lo tanto, su valor desde un punto de vista nutricional /
fisiológico Punto de vista está bajo investigación.
1.4.6.2.3 Reacciones
redox que implican cisteína y cistina
Los enlaces disulfuro
tienen una fuerte influencia Propiedades de las proteínas. El gluten de trigo puede
ser Modificado por reducción de sus enlaces disulfuroA grupos sulfhidrilo y
posterior reoxidación De estos grupos bajo diversas condiciones (Fig. 1.48). La
reoxidación de una suspensión diluida En la presencia de urea da como resultado
una Soluble, producto adhesivo (gluten A), mientras que Reoxidación de una
suspensión concentrada en La presencia de una mayor concentración de urea Produce
un producto insoluble, rígido y cohesivo (Gluten C). Los datos de viscosidad
adicionalesMostró que los puentes disulfuro en gluten A son en su mayoría
intramoleculares, mientras que los de El gluten C es predominantemente
intermolecular(Fig. 1.49).
1.4.6.3 Modificación enzimática
Del gran número de
reacciones enzimáticas con Proteína como sustrato (ver 1.4.5), sólo una pequeña
Hasta la fecha se ha comprobado que son adecuados para Uso en la elaboración de
alimentos.
1.4.6.3.1
Desfosforilación
La figura 1.50 usa la β-caseína como ejemplo para mostrar Que
la solubilidad de una fosfoproteína en presencia De iones de calcio se mejora
en gran medida mediante Desfosforilación enzimática.
1.4.6.3.2 Reacción de
plasteína
La reacción plasteína permite que los fragmentos peptídicos De
un hidrolizado para unirse enzimáticamente a través de Péptido, formando un
polipéptido mayor de La velocidad de reacción se ve afectada, entre otros Cosas,
la naturaleza de los residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos
hidrófobos son preferiblemente (Fig.1.51).
Incorporación de Ésteres
de aminoácidos en la proteína se ve afectada Cadena de alquilo del éster.
Alquilo de cadena corta Los ésteres tienen un bajo índice de incorporación Los
ésteres alquílicos de cadena larga tienen una tasa de incorporación. Esto es
especialmente importante La incorporación de aminoácidos con un lado corto Cadena,
tal como alanina (véase la Tabla 1.40).
La reacción plasteína puede ayudar a mejorar la Valor de una
proteína. La figura 1.52 muestra El enriquecimiento plastificado de zeína con
triptófano, Treonina y lisina. La composición de aminoácidos De tal producto
zeína-plas- tina se da en Tabla 1.41.
Enriquecimiento de una proteína con aminoácidos
seleccionados Puede lograrse con el aminoácido correspondiente Ésteres de
ácidos o, igualmente bien, utilizando Hidrolizados de otra proteína.
La figura 1.53 presenta el ejemplo de la proteína de soja Enriquecimiento
con amino que contiene azufre Ácidos a través de la "adulteración"
con la Hidrolizado de queratina de lana. El PER (proteína Eficiencia) de tales
productos de plas- tina Se han mejorado significativamente, como se Tabla 1.42.
La figura 1.54 muestra que la producción de plas- Con un
perfil de aminoácidos muy próximo al recomendado FAO / OMS puede lograrse a
partir de Muy diversas proteínas.
La reacción plas- tina también permite Mejorar la solubilidad
de una proteína, por ejemplo, Aumentando el contenido de ácido glutámico (Figura
1.55). Una proteína de soja con un 25% de glutámico Ácido produce una plas-
tina con un 42% de ácido glutámico.
La proteína de soja tiene un mínimo de solubilidad
pronunciado En el intervalo de pH de 3 - 6. El mínimo es Mucho menos
pronunciada en el caso de los Plas- tina, mientras que el ácido glutámico enriquecido
Soja tiene una solubilidad satisfactoria sobre el Todo el rango de pH (Fig. 1.56)
y también es resistente a Coagulación térmica (Fig. 1.57).
Proteínas con un mayor contenido de glutamato Muestran un
interesante efecto sensorial: parcial Hidrólisis de la plas- tina modificada no
resulta En un sabor amargo, sino que genera un pronunciado "Caldo de
carne" (Tabla 1.43).
Eliminación del sabor amargo de una proteína Hidrolizado
también es posible sin incorporación De aminoácidos hidrófilos. Degustación
amarga Péptidos, tales como Leu-Phe, que son liberados por Hidrólisis parcial
de la proteína, reaccionan preferentemente En la reacción de plas- tina
subsiguiente y se incorporan En péptidos de mayor peso molecular Con un sabor
neutro.
La versatilidad de la reacción de plas-Demostrado por
ejemplos en los que indeseables Los aminoácidos se eliminan de una proteína.
Una dieta libre de fenilalanina, que puede prepararse Mezclando
aminoácidos, se recomienda para Ciertos defectos metabólicos. Sin embargo, el
uso de Un peso molecular más alto libre de fenilalanina Péptido es más
ventajoso con respecto a Sensitivas y osmóticas. Tales péptidos Pueden
prepararse a partir de proteínas mediante la plas- tina reacción. En primer
lugar, la proteína se hidroliza parcialmente Con pepsina. Tratamiento con
pronasa bajo Condiciones adecuadas luego se libera preferentemente Aminoácidos
con cadenas laterales hidrofóbicas largas.
Los péptidos restantes se separan por gel Cromatografía y
luego se sometió a la plas-Reacción en presencia de tirosina añadida Y el
triptófano (figura 1.58). Esto produce una plas-Que está prácticamente libre de
fenilalanina y tiene Una relación predeterminada de otros aminoácidos, Incluyendo
tirosina (Tabla 1.44).
La reacción de plas- tina también puede llevarse a cabo como
Un proceso de un solo paso (Fig. 1.59), poniendo Reacciones al uso económico, a
escala industrial.
1.4.6.3.3 Enlace
cruzado
La reticulación entre moléculas de proteínas es Alcanzado
con la transglutaminasa (véase 2.7.2.4) Y con peroxidasa (véase 2.3.2.2). La
reticulación Ocurre entre los residuos de tirosina cuando Una proteína se
incuba con peroxidasa / H2O2 (Véase la Reacción 1.163).
Incubación de proteínas con peroxidasa / H2O2 / catecol También
da como resultado reticulación. Las reacciones en Este caso son la desaminación
oxidativa de la lisina Residuos, seguidos de condensaciones de aldol y
aldimina, yo. mi. Reacciones análogas a las catalizadas Por lisil oxidasa en el
tejido conectivo:
1.4.7 Proteínas
Texturizadas
1.4.7.1 Prefacio
La proteína producida para la nutrición en el mundo Es
actualmente alrededor del 20% de fuentes animales Y el 80% de fuentes vegetales.
Las proteínas vegetales Son principalmente de cereales (57%) y oleaginosas (16%).
Algunas fuentes no convencionales de (Proteínas de una sola célula, hojas)
también Adquirieron cierta importancia.
Las proteínas son responsables de las distintas Estructura
de una serie de alimentos, e. gramo. el fibroso Estructura del tejido muscular
(carne, pescado), poroso Estructura del pan y la estructura del gel de algunos
Productos lácteos y soja.
Muchas proteínas vegetales tienen una estructura globular Y,
aunque están disponibles en grandes cantidades, Sólo se utiliza en una medida
limitada en la elaboración de alimentos.
En un intento de ampliar el uso de tales proteínas, Una
serie de procesos se desarrollaron en la Mediados de 1950 que confieren una
estructura similar a una fibra A proteínas globulares. Los procesos adecuados Productos
con fuerza de cocción y una carne estructura. Se comercializan como
extendedores de carne Y análogos de la carne y se puede utilizar siempre que Se
desea una estructura grumosa.
1.4.7.2 Material de
inicio
Las siguientes fuentes de proteínas son adecuadas para la Producción
de productos texturizados: soja; caseína; gluten de trigo; Comidas de semillas
oleaginosas tales como semillas de algodón, El maní, el sésamo, el girasol, el
cártamo o colza Zeína (proteína de maíz); levadura; suero; sangre plasma; O
despojos de la planta de empaque, como los pulmones o Tejido estomacal
El contenido de proteína requerido del material de partida Varía
y depende del proceso utilizado para Texturización. El material de partida es a
menudo una mezcla Tales como soja con lactoalbúmina, o proteína Más
polisacárido ácido (alginato, carragenano O pectina).
La adecuación de las proteínas para la texturización varía, Pero
el peso molecular debe estar en el intervalo de 10-50 kdal. Las proteínas de
menos de 10 kdal son débiles Fibra óptica, mientras que los que superan los 50
kdal Desventajosas debido a su elevada viscosidad y Tendencia a gel en el rango
de pH alcalino. La proporción De residuos de aminoácidos con el lado polar Las
cadenas deben ser altas con el fin de mejorar la interacción Unión de cadenas.
Cadenas laterales abultadas Tales interacciones, de manera que las cantidades
de Los aminoácidos con estas estructuras deben ser bajos.
1.4.7.3 Texturización
La proteína globular se desdobla durante la texturización Rompiendo
la unión intramolecular efectivo. Las cadenas de proteínas extendidas
resultantes son Estabilizado mediante la interacción con las Cadenas En la
práctica, la texturización se Una de dos maneras:
• La proteína de partida se solubiliza y la resultanteLa
solución viscosa se extruye a través Una tobera de hilatura en un baño
coagulante proceso).
• La proteína de partida se humedece ligeramente y Entonces,
a alta temperatura y presión, se extruyeCon fuerza de corte a través de los
orificios deUn dado (proceso de extrusión).
1.4.7.3.1 Proceso de
centrifugado
El material de partida (contenido en proteínas> 90%, por
ejemplo,Un aislado de proteína de soja) se suspende en agua ySolubilizado por
la adición de álcali. La solución al 20%Se envejece después a pH 11 con
agitación constante.
La viscosidad aumenta durante este tiempo como la proteína Despliega
La solución se presiona a continuación Orificios de un dado (5000-15,000
orificios, cada uno Un diámetro de 0,01-0,08 mm) en un coagulante Baño a pH 2-3.
Este baño contiene un ácido (Cítrico, acético, fosfórico, láctico o
clorhídrico) Y, usualmente, NaCl al 10%. Soluciones de hilatura de Proteínas y
mezclas de polisacáridos ácidos también Contienen sales de tierras alcalinas.
Las fibras proteicas Se prolongan más (hasta aproximadamente 2 a 4 veces La
longitud original) en un paso de "liquidación" y Se empaquetan en fibras
más gruesas con diámetros De 10-20 mm. Las interacciones moleculares son Mejorado
durante el estiramiento de la fibra, Aumentando la resistencia mecánica de la
fibra manojos.
El disolvente adherente se elimina luego presionando Las
fibras entre rodillos, colocándolas luego En un baño de neutralización (NaHCO3
+ NaCl) de PH 5,5-6 y, ocasionalmente, también en un endurecimiento
Baño (NaCl conc.).Los haces de fibras se pueden combinar en
Agregados con diámetros de 7-10 cm.
El tratamiento adicional implica el paso delHaces a través
de un baño que contiene un aglutinante y Otros aditivos (una proteína que
coagula cuando Calentado, tal como proteína de huevo; almidón modificado U
otros polisacáridos; Compuestos aromáticos; Lípidos). Este tratamiento produce
haces con Estabilidad térmica y aroma mejorados. un típico Baño para las fibras
que se van a transformar en Un análogo de carne podría consistir en 51% de
agua, 15% de ovoalbúmina, 10% de gluten de trigo, 8% de soja Harina, 7% de
cebolla en polvo, 2% de hidrolizado de proteínas, 1% de NaCl, 0,15% de
glutamato monosódico y 0,5% de pigmentos. Finalmente, los haces de fibra
embebidos se calientan y Cortado
1.4.7.3.2 Proceso de
extrusión
El contenido de humedad del material de partida (proteína
Contenido de aproximadamente el 50%, e. G., Harina de soja) se ajusta A 30-40%
y aditivos (NaCl, tampones, Compuestos aromáticos, pigmentos).
Los compuestos aromáticos se añaden en la grasa como un
vehículo, Cuando sea necesario, después de la etapa de extrusión para compensar
Para las pérdidas de aroma. La mezcla de proteínas Se introduce en el extrusor
(un termostato Cilindro o cuerpo cónico que contiene Un tornillo pulido y
giratorio con un gradualmente decreciente Tono) que se calienta a 120-180 ◦C Y
desarrolla una presión de 30-40 bar. Bajo estas La mezcla se transforma en un
plástico, Estado viscoso en el que se dispersan sólidos En la proteína fundida.
Hidratación de la proteína Ocurre después del despliegue parcial de la
Moléculas y estiramiento y reordenamiento De las cadenas de proteína a lo largo
de la dirección de la masa transferir.
El proceso se ve afectado por la tasa de rotación y Forma
del tornillo y por la transferencia de calor Y la viscosidad del material
extruido y su Tiempo de residencia en el extrusor. Como material fundido Sale
del extrusor, el agua se vaporiza, Dejando vacuolas en la proteína ramificada
Hilos El proceso de extrusión es más económico Que el proceso de centrifugado.
Sin embargo, produce fibras Partículas en lugar de fibras bien definidas. Una
gran cantidad y variedad de extrusoras son Ahora en funcionamiento. Al igual
que con otros procesos alimenticios, Existe una tendencia hacia el desarrollo y
la utilización de Extrusión de alta temperatura / corto tiempo cocina.
3.5 Reacciones Catalizadas por Enzimas
1.4.5.1 Prefacio
Un gran número y variedad de enzimas catalizadas Las
reacciones se conocen con la proteína como sustrato.
Estas incluyen reacciones hidrolíticas (escisión de Enlaces peptídicos
u otros enlaces, e. G, el éster Enlace en una fosfoproteína), reacciones de
transferencia (Fosforilación, incorporación de residuos acilo, Residuos de azúcar
y grupos metilo) y redox Reacciones (oxidación de tiol, reducción de disulfuro,
Oxidación o incorporación de grupos amino grupos hidroxilo). La Tabla 1.32 es
una compilación De algunos ejemplos. Algunas de estas reacciones son En la sección
1.4.6.3 o en las secciones Relacionados con los alimentos individuales. Sólo
enzimas Que están implicados en la hidrólisis de enlaces peptídicos (Enzimas
proteolíticas, peptidasas) serán cubiertos En las siguientes secciones.
1.4.5.2 Enzimas
proteolíticas
Los procesos que implican la proteólisis desempeñan un Producción
de muchos alimentos. Proteólisis puede ocurrir Como resultado de las
proteinasas en el alimento mismo, e. gramo., Reacciones autolíticas en la
carne, o debido a Proteinasas, e. G., La adición de cultivos puros de Microorganismos
seleccionados durante la producción de queso.
Este gran grupo de enzimas se divide en Mostrada en la Tabla
1.33. Los dos subgrupos formados Son: peptidasas (exopeptidasas) que escinden
amino Ácidos o dipéptidos gradualmente desde el terminal Extremos de proteínas
y proteinasas (endopeptidasas) Que hidrolizan los enlaces dentro de la Peptídica,
no atacando el péptido terminal cautiverio. Una división adicional es posible,
por ejemplo, Teniendo en cuenta la presencia de una Residuo de aminoácido en el
sitio activo del enzima. Los tipos más importantes de proteolíticos Enzimas se
presentan en los siguientes Secciones.
1.4.5.2.1
Endopeptidasas de serina
Las enzimas de este grupo, en las que la actividad es Confinados
al rango de pH de 7-11, se indican Como proteinasas alcalinas. Representantes
típicos De fuentes animales son tripsina, quimotripsina, Elastasa, plasmina y
trombina. Serinas proteinasas Son producidos por un gran número de Bacterias y
hongos, e. gramo. Bacillus cereus, B. firmus, B. licheniformis, B. megaterium,
B. subtilis, Serratia marcescens, Streptomyces fradiae, S. griseus, álbum de
Trititrachium, Aspergillus Flavus, A. oryzae y A. sojae.
Estas enzimas tienen en común la presencia de Una serina y
un residuo de histidina en sus sitios activos (Para el mecanismo, véase
2.4.2.5).
La inactivación de estas enzimas es posible Con reactivos
tales como diisopropilfluorofosfato (DIFP) o fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF).
Estos reactivos acilan irreversiblemente
El residuo de serina en el sitio activo de las enzimas:
La inhibición irreversible también puede Presencia de
metilcetonas halogenadas que Alquilar el residuo activo de histidina (véase
2.4.1.1), O como resultado de la acción de inhibidores de proteinasas, Que son
también proteínas, por la interacción Con la enzima para formar complejos
inactivos.
Estos inhibidores naturales se encuentran en los órganos De
animales y plantas (páncreas, calostro, Clara de huevo, tubérculo de patata y
semillas de muchos leguminosas; Cf. 16.2.3). La especificidad de la serina Endopeptidasas
varía mucho (véase la Tabla 1.34).
La tripsina excluye exclusivamente los enlaces de amino Residuos
ácidos con una cadena lateral básica (lisilo o Arginilo) y quimotripsina
preferentemente Cliva enlaces de residuos de aminoácidos que Tienen cadenas
laterales aromáticas (fenilalanilo, tirosil O enlaces triptófanilo). Enzimas de
microorganismos Origen son a menudo menos específicos.
1.4.5.2.2
Endopeptidasas de cisteína
Representantes típicos de este grupo de enzimas Son: papaína
(de la savia de un melón tropical Árbol frutal, Carica papaya), bromelina (del Savia
y tallo de piña, Ananas comosus), Ficina (de Ficus latex y otros Ficus spp.) Y Una
proteinasa de Streptococcus. El rango de actividad De estas enzimas es muy
amplia y, dependiendo de El sustrato, es de pH 4,5-10, con un máximo de PH 6-7,5.
El mecanismo de actividad enzimática aparece Para ser
similar a la de serina endopeptidasas. Un residuo de cisteína está presente en
el sitio activo.
Un tioéster se forma como un intermediario covalente producto.
Las enzimas son altamente sensibles a agentes oxidantes. Por lo tanto, por
regla general, Utilizado en presencia de un agente reductor (por ejemplo, Cisteína)
y un agente quelante (por ejemplo, EDTA).
La inactivación de las enzimas es posible con la oxidación Agentes,
iones metálicos o reactivos alquilantes (Ver 1.2.4.3.5 y 1.4.4.5). En general,
estas enzimas No son muy específicos (véase la Tabla 1.34).
1.4.5.2.3 Metalo
Peptidases
Este grupo incluye exopeptidasas, carboxipeptidasas A y B,
aminopeptidasas, dipeptidasas, Prolidasa y prolinasa, y endopeptidasas De bacterias
y hongos, como Bacillus Cereus, B. megaterium, B. subtilits, B.
thermoproteolyticus (Termolisina), Streptomyces Griseus (pronase, también
contiene carboxi y Aminopeptidasas) y Aspergillus oryzae.
La mayoría de estas enzimas contienen un mol de Zn2 + Por
mol de proteína, pero prolina y prolinasa Contienen un mol de Mn ^ {2+}. El ion
metálico actúa Como un ácido de Lewis en la carboxipeptidasa A, estableciendo Contacto
con el grupo carbonilo del péptido Que debe escindirse. La figura 1.41 muestra La
disposición de otros residuos participantes En el sitio activo, tal como se ha
revelado por rayos X estructurales Análisis del complejo enzima-sustrato.
Las enzimas son activas en el intervalo de pH 6-9; su La
especificidad es generalmente baja (ver Tabla 1.34).
La inhibición de estas enzimas se logra con Agentes
quelantes (por ejemplo EDTA) o dodecil de sodio sulfato.
1.4.5.2.4
Endopeptidasas aspárticas
Los representantes típicos de este grupo son las enzimas De
origen animal, como la pepsina y la renina (Denominada Lab-enzyme en Europa),
activa en la Rango de pH de 2-4, y catepsina D, que Un pH óptimo entre 3 y 5
dependiendo de la Sustrato y en la fuente de la enzima. A El pH 6-7 renina escinde
un enlace de κ-caseína con Gran especificidad, causando así el cuajado de la
leche (Véase 10.1.2.1.1).
Las proteinasas aspárticas de origen microbiano pueden ser Clasificados
como pepsina-like o renina-como las enzimas.
Estos últimos son capaces de coagular la leche. Los Se
producen enzimas de tipo pepsina, por ejemplo, Por Aspergillus awamori, A.
niger, A. oryzae, Penicillium spp. Y Trametes sanguinea. Los Se producen
enzimas similares a renina, por ejemplo, Por Aspergillus usamii y Mucor spp.,
Tales como M. pusillus. Hay dos grupos carboxilo, uno en el grupo no disociado ,
En el sitio activo de proteinasas aspárticas.
El mecanismo postulado para la escisión De enlaces
peptídicos se ilustra en la Reacción 1.159.
El ataque nucleofílico de una molécula de agua El átomo de
carbono carbonilo del enlace peptídico Es catalizada por las cadenas laterales
de Asp-32 (base Catalizador) y Asp - 215 (catalizador ácido). La numeración De
los residuos de aminoácidos en el sitio activo Se aplica a la proteinasa
aspártica de Rhizopus Chinensis La inhibición de estas enzimas se logra con Diversos
ésteres de diazoacetilaminoácidos, que aparentemente Reaccionan con grupos
carboxilo en el Sitio, y con pepstatina. Esta última está aislada de Streptomycetes
como una mezcla de péptidos con La fórmula general (R: isovalerico o n-caproico
ácido; AHMHA: 4 - amino - 3 - hidroxi - 6 – metil Heptanoico):
Se especifica la especificidad de las endopeptidasas
aspárticas En la Tabla 1.34
3.4 REACCIONES QUIMICAS
La modificación química de la proteína es Importancia para
una serie de razones. Proporciona Derivados adecuados para el análisis de
secuencias, Identifica los grupos reactivos en forma catalítica Sitios activos
de una enzima, permite la unión de Proteína a un portador (inmovilización de
proteínas) y Proporciona cambios en las propiedades proteicas que son Importante
en la elaboración de alimentos. En contraste con el Aminoácidos y, a excepción
de los relativamente pequeños Número de grupos funcionales en el terminal Aminoácidos,
sólo los grupos funcionales Las cadenas laterales de proteínas están
disponibles para reacciones.
3.4.1 Residuo de
lisina
Las reacciones que implican el residuo de lisina se pueden
dividir En varios grupos, (a) reacciones que conducen a Un derivado cargado
positivamente, (b) reacciones que eliminan La carga positiva, (c) derivatizaciones
que introducen Una carga negativa, y (d) reacciones reversibles.
Estos últimos son de particular importancia.
3.4.1.1 Reacciones
que retengan
La carga positiva La alquilación del grupo amino libre de
lisina con Aldehídos y cetonas es posible, con una Reducción:
Un derivado de dimetilo [Prot - N (CH _ {3}) _ {2}] puede Se
obtiene con formaldehído (R = R ^ {1} = H) (Véase 1.2.4.2.2).
La guanidinación puede lograrse usando O-metilisourea como
reactivo. Los grupos \ alpha – amino Reaccionan a una velocidad mucho más lenta
que ε-amino grupos:
Esta reacción se utiliza analíticamente para evaluar La cantidad
de \ varepsilon – amino Y para medir la digestibilidad de las proteínas.
También es posible la derivatización con ésteres imidos.
El reactivo es fácilmente accesible a partir del
correspondiente nitrilos:
Las proteínas pueden ser reticuladas con el uso de un
bifuncional Imido éster (véase 1.4.4.10). El tratamiento del residuo de
aminoácido con Carbohidratos de aminoácidos produce una policondensación Producto
de reacción:
El valor n depende de las condiciones de reacción.
Los carbohidratos son fácilmente accesiblesMediante la
interacción del aminoácido con
3.4.1.2 Reacciones
que resultan en una pérdida
De Carga Positiva El anhídrido acético reacciona con lisina,
cisteína, Histidina, serina, treonina y tirosina.
El tratamiento subsiguiente de la proteína con hidroxilamina
(1M, 2 h, pH 9, 0 ◦C) deja sólo el Grupos amino acetilados intactos:
Carbamoilación con ataques de cianato α- y Grupos ε-amino
así como cisteína y tirosina Residuos. Sin embargo, su derivatización es Reversible
en condiciones alcalinas:
La arilación con 1 - fluoro - 2,4 – dinitrobenceno (Reactivo
de Sanger, FDNB) y trinitrobenceno Sulfónico se describe en la Sección
1.2.4.2.2.
El FDNB también reacciona con cisteína, histidina y Tirosina.
Ácido 4 - fluoro - 3 - nitrobenceno sulfónico, un reactivo Que
tiene buena solubilidad en agua, también es de interés Para derivatización de
proteínas:
La desaminación puede realizarse con nitrógeno ácido:
Esta reacción implica grupos α- y ε-amino Así como triptófano,
tirosina, cisteína y Metionina.
3.4.1.3 Reacciones
resultantes
En una carga negativa Acilación con anhídridos de ácidos
dicarboxílicos, p. gramo.
Anhıdrido de ácido succınico, introduce un Grupo en la
proteína:
La introducción de un grupo de ácido fluorescente es posible
Por interacción de la proteína con piridoxal Fosfato seguido por la reducción
del Base de Schiff:
3.4.1.4 Reacciones
reversibles
Los derivados N-maleílicos de proteínas se obtienen al PH
alcalino por reacción con anhıdrido de ácido maleico.
El producto acilado se escinde a pH <5, Regenerar la
proteína:
La semivida (τ) de ε-N-maleil lisina es de 11 h A pH 3,5 y
37 ◦C. Una escisión más rápida es Observada con el derivado 2 - metil – maleílico
(Τ <3 min a pH 3,5 y 20 ◦ C) y El derivado 2,2,3,3-tetrafluoro-succinilo (\
cr Muy bajo a pH 9,5 y 0◦C). La cisteína se une Anhídrido maleico a través de
una reacción de adición. El derivado S-succinilo es bastante estable.
Esta reacción secundaria es, sin embargo, La derivatización
de proteínas se realiza con exo-cis- 3,6 - end - oxo - 1,2,3,6 –
tetrahidroftálico Anhídrido Para lisina ε-N-acilada, τ = 4-5 h a pH 3 y 25 ◦C.
Los derivados de acetoacetilo se obtienen con diceteno:
Este es el tipo de reacción que también se produce con
cisteína Y residuos de tirosina. El grupo acilo es fácilmente Se separaron de
la tirosina a pH 9,5. Lanzamiento completo De la proteína de su forma
derivatizada es posible Por tratamiento con fenilhidrazina o hidroxilamina A pH
7.
3.4.2 Residuo de
arginina
El residuo de arginina de las proteínas reacciona con α- o Β-dicarbonilo
para formar derivados cíclicos:
El derivado de nitropirimidina absorbe al 335 nm. El enlace
arginilo de este derivado es No se escinde por tripsina sino que se escinde en
su Tetrahidro, obtenido por reducción con NaBH _ {4} (véase la Reacción 1.113).
En la reacción Con benzilo, un derivado de iminoimidazolidona Se obtiene
después de un reestructuración ácida bencılica (Véase la Reacción 1.114).
La reacción del residuo de arginina con 1,2- Ciclohexanodiona
es altamente selectiva y Procede bajo condiciones suaves. Regeneración Del
residuo de arginina es de nuevo posible con Hidroxilamina (véase la Reacción
1.115).
3.4.3 Residuos de
ácido glutámico y aspártico
Estos residuos de aminoácidos están normalmente esterificados
Con HCl metanólico. Puede haber reacciones secundarias, Tales como metanólisis
de derivados de amida O migración de N, O-acilo en serina o treonina residuos:
La diazoacetamida reacciona con un grupo carboxilo y También
con el residuo de cisteína:
Los ésteres de aminoácidos u otros compuestos nucleófilos
similares Pueden unirse a un grupo carboxilo Grupo de una proteína con la ayuda
de una carbodiimida: La amidación también es posible activando la Carboxilo con
una sal de isooxazolio (Woodward Reactivo) a un enolaster y su conversión Con
una amina.
3.4.4 Residuo de
cistina
(Véase también la sección 1.2.4.3.5) La escisión de cistina
es posible por un nucleófilo ataque:
La reactividad nucleófila de los reactivos Disminuye en la
serie: hidruro> arsenito y Fosfito> alcanotiol> aminoalcanotiol >
Tiofenol y cianuro> sulfito> OH-> P-nitrofenol> tiosulfato>
tiocianato. La escisión con borohidruro sódico y con Tioles en la sección
1.2.4.3.5. Completar Clivaje con sulfito requiere que la oxidación Agentes (por
ejemplo, Cu2 +) y que el pH sea Mayor que 7:
El derivado S-sulfo resultante es bastante estable en Neutro
y ácido y es bastante soluble en agua. El grupo S-sulfo puede eliminarse con Un
exceso de reactivo tiol.
La escisión de residuos de cistina con cianuros (nitrilos) Es
de interés ya que el tiocianato formado En la reacción se cicliza a una
2-iminotiazolidina Derivado con escisión del enlace N - acilo:
Esta reacción puede utilizarse para Clivaje de las cadenas
peptídicas. Inicialmente, todo el disulfuro Los puentes se reducen con
ditiotreitol, y Luego se convierten en disulfuros mixtos a través de Reacción
con 5,5 \ alpha - ditio - bis- (2 - nitro – benzoico ácido). Estos disulfuros
mixtos son entonces escindidos por Cianuro a pH 7.
La escisión electrofílica se produce con Ag + y Hg + O Hg ^
{2+} como sigue:
La escisión electrofílica con H + sólo es posible en Ácidos
fuertes (por ejemplo, 10 mol / l de HCl). El sulfenio Catión que se forma puede
catalizar un disulfuro Reacción de intercambio:
En soluciones neutras y alcalinas, un intercambio de
disulfuro La reacción es catalizada por el anión tiolato
3.4.5 Residuo de
cisteína
(Véase también la sección 1.2.4.3.5)
Una serie de agentes alquilantes producen derivados Que son
estables bajo las condiciones para ácidos Hidrólisis de proteínas. La reacción
con etileno Imina dando un derivado S-aminoetilo y, Por lo tanto, una posición
de unión adicional en la proteína Para la hidrólisis por tripsina, se mencionó
en Sección 1.4.1.3. El ácido yodoacético, dependiendo del PH, puede reaccionar con
cisteína, metionina, lisina Y residuos de histidina:
La introducción de grupos metilo es posible Con yoduro de
metilo o metil-isourea, y el Introducción De grupos metiltio con
metiltiosulfonilmetano:
Anhídrido de ácido maleico y metil-p-nitrobenceno Sulfonato
son también agentes alquilantes:
Una serie de reactivos permiten medir El contenido de grupos
tiol espectrofotométricamente.
El coeficiente de absorción molar, ε, para el Derivado de
bromuro de azobenceno - 2 - sulfenilo, Ε353, es de 16.700 M-1 cm-1 a pH 1:
El ácido 5,5 \ alpha - ditiobis- (2 - nitrobenzoico) tiene
un ligero Ε412 inferior de 13.600 a pH 8 para su producto, un anión de
tionitrobenzoato:
El derivado de p-hidroxivercuribenzoato tiene Un ε250 de 7500
a pH 7, mientras que el derivado De imida N - etilmaleica tiene un \ leq 300 de
620 \ mu l a PH 7:
Especialmente adecuado para el aislamiento específico de Péptidos
que contienen cisteína de gran sensibilidad Es imida de ácido N –
dimetilaminoazobencenemaleico (DABMA).
3.4.6 Residuo de
metionina
Los residuos de metionina se oxidan a sulfóxidos Con
peróxido de hidrógeno. El sulfóxido
Puede ser reducido, regenerando metionina, Utilizando un
exceso de reactivo de tiol (Véase 1.2.4.3.6). Los ácidos α-halógeno-carboxılicos,
Β-propiolactona y alquil halogenuros se convierten Metionina en derivados de
sulfonio, A partir de los cuales se puede regenerar metionina en Un medio
alcalino con un exceso de tiol reactivo:
La reacción con bromuro de cianógeno (BrCN), que Divide el
enlace peptídico en el lado carboxilo De la molécula de metionina, se delineó
en Sección 1.4.1.3.
3.4.7 Residuo de
histidina
Modificación selectiva de los residuos de histidina Presentes
en sitios activos de serina proteinasas es posible. Los análogos del sustrato
tales como Las cetonas metiladas halogenadas inactivan tales Enzimas (por
ejemplo, 1-cloro-3-tosilamido- 7-aminoheptan-2-ona inactiva tripsina y 1- Cloro
- 3 - tosilamido - 4 - fenilbutan - 2 – ona Quimotripsina) por N-alquilación
del Residuo histidina:
3.4.8 Residuo de
triptófano
La N-bromosuccinimida oxida el triptófano Cadena lateral y
también tirosina, histidina y cisteína:
La reacción se utiliza para la escisión selectiva de Cadenas
peptídicas y la determinación espectrofotométrica De triptófano.
3.4.9 Residuo de
tirosina
La acilación selectiva de la tirosina puede Acetilimidazol
como reactivo:
El ácido arsanílico diazotizado reacciona con la tirosina y Con
histidina, lisina, triptófano y arginina:
El tetranitrometano introduce un grupo nitro en La posición
orto:
3.4.10 Reactivos
bifuncionales
Los reactivos bifuncionales permiten la interacción intra e
intermolecular Reticulación de proteínas. Ejemplos son Imidoéster bifuncional,
fluoronitrobenceno, isocianato Derivados e imidas de ácido maleico:
3.4.11 Reacciones involucradas en los alimentos.
3.4.11 Reacciones involucradas en los alimentos.
Tratamiento La naturaleza y extensión de los cambios químicos inducidos En las proteínas por el procesamiento de alimentos dependen de Una serie de parámetros, por ejemplo, composición Alimentos y las condiciones de elaboración, Como la temperatura, el pH o la presencia de oxígeno. Como Una consecuencia de estas reacciones, la biológica El valor de las proteínas puede disminuir:
• Destrucción de aminoácidos esenciales
• Conversión de aminoácidos esenciales en Derivados que no son metabolizables
• Disminución de la digestibilidad de las proteínas como resultado De entrecruzamiento intra o inter-cadena.
La formación de productos de degradación tóxica posible. La evaluación nutricional / fisiológica y toxicológica Evaluación de los cambios inducidos por el procesamiento De alimentos es un tema de controversia Y opiniones opuestas.
La reacción de Maillard del grupo ε-amino de La lisina prevalece en presencia de azúcares reductores, Por ejemplo, lactosa o glucosa, que producen Ε-N-desoxilactulosil-1-lisina unida a proteína o Ε-N-desoxi-fructosil-1-lisina, respectivamente. Lisina No está biológicamente disponible en estas formas.
La hidrólisis ácida de dicha reacción primaria Producen lisina, así como la degradación Productos furosina y piridosina en una (Véase 4.2.4.4):
Un azúcar no reductor (por ejemplo sacarosa) también puede Causar una pérdida de lisina cuando las condiciones para el azúcar Hidrólisis son favorables.
Las pérdidas de lisina, cistina, serina, treonina, Arginina y algunos otros aminoácidos A valores de pH más altos. Hidrolizados de álcalis Las proteínas a menudo contienen Compuestos, tales como ornitina, β-aminoalanina, Lisinoalanina, ornitinoalanina, lantionina, Metillantotionina y D-aloiso-leucina, así como Como otros D-aminoácidos.
La formación de estos compuestos se basa en la Siguientes reacciones: 1,2-eliminación en el caso de Resultados de hidroxi aminoácidos y aminoácidos En ácido 2 - amino - acrílico (deshidroalanina) o ácido 2 - Ácido aminocrotónico (ácido deshidroaminobutírico):
En el caso de la cistina, la tiolcisteína eliminada Pueden formar un segundo residuo de deshidroalanina:
Alternativamente, la escisión del disulfuro de cistina Enlace puede ocurrir por ataque nucleofílico sobre azufre, Dando un resto de deshidroalanina a través de tiol y Intermedios de sulfinato:
Reticulación intra e inter-cadena de proteínas Puede ocurrir en las reacciones de deshidroalanina que Adiciones de aminas y tioles. El amoníaco puede También reaccionan a través de una reacción de adición La hidrólisis ácida de dicha proteína reticulada Produce los aminoácidos inusuales listados en Tabla 1.29. La ornitina se forma durante la escisión De arginina (Reacción 1.54).
La formación de D-aminoácidos se produce a través de Abstracción de un protón a través de un carbanión C2.
La reacción con L-isoleucina es particularmente interesante. L-isoleucina se isomeriza a D - aloisoleucina que, a diferencia de otros D – amino Ácidos, es un diastereoisómero y por lo tanto tiene una retención Tiempo diferente de la L-isoleucina, haciendo Posible directamente de un aminoácido Cromatograma ácido:
Calentamiento de proteínas en estado seco a pH neutro Da lugar a la formación de enlaces isopeptídicos Entre los grupos \ varepsilon - amino de los residuos de lisina Y los grupos β- o γ-carboxamida de la asparagina Y residuos de glutamina:
Estos enlaces isopéptidos se escinden durante Hidrólisis de proteínas y, por lo tanto, no Contribuyen a la aparición de aminoácidos Ácidos. Un tratamiento térmico más intensivo de proteínas En presencia de agua conduce a una mayor degradación.
Los cambios oxidativos en las proteínas Metionina, que forma relativamente fácilmente metionina sulfóxido:
Se observó la formación de sulfóxido de metionina En relación con la peroxidación lipídica, el fenol Oxidación y exposición a la luz en presencia De oxígeno y sensibilizadores tales como riboflavina.
Después de la reducción in vivo a la metionina, El sulfóxido de metionina es aparentemente biológicamente disponible.
La figura 1.37 muestra el efecto del tratamiento alcalino De un aislado de proteínas de semillas de girasol. Serina Treonina, arginina e isoleucina Se reducen marcadamente con concentraciones crecientes De NaOH. Nuevos aminoácidos (ornitina Y aloisoleucina). Inicialmente, lisina Concentración disminuye, pero aumenta a Concentraciones de álcali. Lysinoalanine se comporta en La manera opuesta. El grado de formación de D-aminoácidos como resultado del tratamiento alcalino de Proteínas se muestra en la Tabla 1.30.
Los datos presentados en las Figs. 1.38 y 1.39 claramente Muestran que la formación de lisinoalanina es Influenciado no sólo por el pH sino también por la proteína fuente. Se produce una reacción extensa en caseína Incluso a pH 5,0 debido a la presencia de fósforo Residuos de serina, mientras que las reacciones Ocurren en gluten de trigo o en zeína de Maíz sólo en el rango de pH de 8-11. Figura 1.40 Ilustra la dependencia de la reacción Concentración de proteínas.
La tabla 1.31 enumera el contenido de lysinoalanine en Productos alimenticios procesados industrialmente o preparados Bajo las "condiciones habituales del hogar".
El contenido está obviamente afectado por la comida Tipo y por las condiciones de procesamiento.
En la radiación de los alimentos, la o-hidroxifenilalanina Llamada o-tirosina se forma a través de la re Acción de fenilalanina con radicales OH. En Hidrolizados, el compuesto se puede detectar con La ayuda de HPLC (detección de fluorescencia o Detección electroquímica). Está en discusión Como indicador de la radiación alimentaria. La cantidad Depende de la dosis irradiada y de la la temperatura. En muestras de pollo y cerdo, Pescado y camarones, <0,1 mg / kg (no irradiados Control), 0,5 - 0,8 mg / kg (5 kGy, -18ºC) y 0,8-1,2 mg / kg (5 kGy, 20 ◦C).
3.3 PROPIEDADES FISICAS
1.4.3.1 Disociación Las
proteínas, al igual que los aminoácidos, son anfóteras.
Dependiendo del pH, pueden existir como polivalentes Cationes,
aniones o iones zwitter. Las proteínas difieren En sus grupos α-carboxilo y
α-amino - ya que Estos grupos están unidos entre sí por el péptido, La
captación o liberación de protones es limitada Para liberar grupos terminales. Por
lo tanto, la mayoría de los Los grupos funcionales disociables se derivan de Cadenas
laterales La tabla 1.28 lista los valores de pK de algunos Grupos de proteínas.
En contraste con los aminoácidos libres, Estos valores fluctúan mucho para las
proteínas, ya que La disociación está influenciada por vecinos Grupos en la
macromolécula. Por ejemplo, Lisozima, el grupo \ gamma - carboxilo de Glu _
{35} tiene un pK De 6-6,5, mientras que el pK del grupo β-carboxilo de Asp66 es
1,5-2, de Asp52 es 3-4,6 y de Asp101 Es 4,2-4,7.
La carga total de una proteína, que es la Suma de todas las
cargas positivas y negativas, Se diferencia de la llamada carga neta Que,
dependiendo del pH, puede ser positivo, Cero o negativo. Por definición, la
carga neta es Cero y la carga total es máxima en el isoeléctrico punto. Bajar o
elevar el pH tiende Para aumentar la carga neta hacia su máximo, Mientras que
la carga total siempre es menor que En el punto isoeléctrico.
Dado que las proteínas interactúan no sólo con protones sino
También con otros iones, hay una diferenciación adicional Entre un punto
isoiónico y un punto isoeléctrico.
El punto isoiónico se define como el pH de una proteína Solución
a dilución infinita, sin otra Iones presentes excepto H + y HO-. Tal proteína Solución
se puede adquirir por extensa diali- (O, mejor, electrodiálisis) contra el
agua. Los El punto isoiónico es constante para una sustancia dada Mientras que
el punto isoeléctrico es variable dependiendo Sobre los iones presentes y su
concentración. En La presencia de sales, i. mi. Cuando la unión de aniones Es
más fuerte que la de los cationes, la isoeléctrica Punto es menor que el punto
isoiónico. Los El reverso es verdadero cuando la unión catiónica es dominante.
La figura 1.33 muestra el cambio en el pH de un Solución
isoiónica de albúmina sérica después de la adición De varias sales. El cambio
en el pH es consistente Positivo, i. mi. La proteína se une más aniones que Cationes.
La curva de titulación de β-lactoglobulina en varios Iones
iónicas (Fig. 1.34) muestra que las fuerzas isoeléctricas Punto de esta proteína,
a pH 5.18, es independiente De las sales presentes. Las curvas de titulación
son, Sin embargo, más pronunciada con el aumento de la fuerza iónica, Que
indica una mayor supresión de la electrostática Interacción entre moléculas de
proteínas.
En su punto isoeléctrico, una proteína es la menos soluble Y
lo más probable es precipitar ( "isoeléctrico Precipitación ") y está
en su máxima cristalización capacidad. La viscosidad de las proteınas
solubilizadas Y el poder de hinchamiento de las proteínas insolubles Están al
mínimo en el punto isoeléctrico.
Cuando la composición de aminoácidos de una proteína es Conocido,
el punto isoeléctrico puede estimarse de acuerdo A la siguiente fórmula:
Donde QpI es la suma de las desviaciones del isoeléctrico De
todos los aminoácidos participantes de El punto neutral:
La fórmula falla cuando los grupos ácidos o alcalinos Ocurren
en forma enmascarada.
1.4.3.2 Actividad
óptica
La actividad óptica de las proteínas se debe no sólo A la
asimetría de los aminoácidos, sino también al Quiralidad resultante del arreglo
de La cadena peptídica. Información sobre la conformación De proteínas se
pueden obtener de Un registro de la dispersión rotatoria óptica (ORD) o el
dicroísmo circular (CD), especialmente En el intervalo de absorción de los
enlaces peptídicos Longitudes de onda (190-200 nm). El efecto de algodón Ocurre
en este rango y revela Información sobre la estructura secundaria. Un \ alpha -
Hélice o una estructura β da un negativo Algodón Efecto, con los máximos de
absorción a 199 y 205 nm, respectivamente, mientras que una La conformación
cambia el máximo a menor Longitudes de onda, i. mi. Resultados en un algodón
positivo (Fig. 1.35).
1.4.3.3 Solubilidad, Hidratación
y poder de inflamacion
La solubilidad de las
proteínas es variable y está influenciada Por el número de grupos polares y
apolares y Su disposición a lo largo de la molécula. En general, Las proteínas
son solubles sólo en Disolventes polares tales como agua, glicerol, formamida, Dimetilformamida
o ácido fórmico.
En un disolvente menos polar como el etanol, las proteínas Rara
vez son notablemente solubles (por ejemplo, Prolaminas). La solubilidad en agua
es dependiente En el pH y en la concentración de sal. La Figura 1.36 muestra
estas relacionesΒ-lactoglobulina.
A bajas fuerzas iónicas, la solubilidad aumenta con Aumento
de la fuerza iónica y el mínimo de solubilidad (Punto isoeléctrico) se cambia
de pH 5,4 a PH 5,2. Este cambio se debe a la unión preferente de Aniones a la
proteína.
Si una proteína tiene suficiente hidrofóbico expuesto Grupos
en el punto isoeléctrico, agrega Debido a la falta de repulsión electrostática A
través de enlaces hidrófobos intermoleculares, y (Isoeléctrica) ocurrirá. si en
Por otro lado, hidrofóbico intermolecular Las interacciones son poco
desarrolladas, Una proteína permanecerá en solución incluso en el Punto
isoeléctrico, debido a la hidratación y estérico repulsión.
Por regla general, las sales neutras tienen un doble efecto Solubilidad
en proteínas. A concentraciones bajas aumentan La solubilidad (efecto de
"salar en") suprimiendo La interacción proteína-proteína
electrostática (Fuerzas de unión).
El logaritmo de la solubilidad (S) es proporcional A la
fuerza iónica (μ) a bajas concentraciones (Véase la figura 1.36):
La solubilidad de las
proteínas disminuye (efecto "salting out")
A mayores concentraciones de sal debido al ion Tendencia a
la hidratación de las sales. La siguiente relación Se aplica (S0: solubilidad en
μ = 0; K: salazón Salida constante):
Cations y aniones en presencia del mismo Contra-ion se
pueden arreglar en las siguientes órdenes (Serie de Hofmeister) basado en su
salting hacia fuera efectos:
Los aniones multivalentes son más eficaces que los monovalentes
Aniones, mientras que los cationes divalentes son menos eficaces Que los
cationes monovalentes.
Dado que las proteínas son sustancias polares, Hidratado en
agua. El grado de hidratación (G de agua de hidratación / g de proteína) es
variable.
Es 0,22 para la ovoalbúmina (en sulfato de amonio), 0,06
para edestina (en sulfato de amonio), 0,8 para β-lactoglobulina y 0,3 para
hemoglobina.
Aproximadamente 300 moléculas de agua son suficientes Para
cubrir la superficie de la lisozima (aproximadamente 6000Å2), que es una
molécula de agua por 20Å2.
La hinchazón de las proteínas insolubles A la hidratación de
proteínas solubles en Inserción de agua entre las cadenas peptídicas Resulta en
un aumento de volumen y otros Cambios en las propiedades físicas de la
proteína.
Por ejemplo, el diámetro de las miofibrillas (Véase 12.2.1)
aumenta hasta 2,5 veces el valor original Durante el aclarado con NaCl 1,0 mol
/ l, Lo que corresponde a un aumento de volumen de seis veces (Véase 12.5). La
cantidad de agua tomada Por hinchazón puede ascender a un múltiplo de El peso
seco de la proteína. Por ejemplo, el músculo El tejido contiene 3,5-3,6 g de
agua por g de proteína seca importar.
La capacidad de retención de agua de la proteína puede
estimarse Con la siguiente fórmula:
(A: g de agua / g de proteína; fc, fp, fn: fracción de Cargados,
polares, residuos de aminoácidos neutros).
1.4.3.4 Formación de
espuma y espuma
Estabilización En varios alimentos, las proteínas funcionan
como espuma Y componentes estabilizadores de la espuma, para Ejemplo en productos
horneados, dulces, postres y cerveza. Esto varía de una proteína a otra.
La albúmina sérica se espuma muy bien, mientras que la
albúmina de huevo no. Mezclas de proteínas como la clara de huevo Puede ser
particularmente adecuado (véase 11.4.2.2).
En este caso, las globulinas facilitan la formación de espuma. Ovomucina
estabiliza la espuma, la albúmina de huevo y La conalbúmina permite su fijación
a través de coagulación.
Las espumas son dispersiones de gases en líquidos. Proteínas
Se estabilizan formando películas flexibles y cohesivas Alrededor de las
burbujas de gas. Durante e impacto, la proteína Se adsorbe en la interfase a
través de una capa hidrófoba áreas; Esto es seguido por el despliegue parcial (Desnaturalización
superficial). La reducción de la superficie La tensión causada por la adsorción
de proteínas facilita La formación de nuevas interfaces y nuevas Burbujas Las
proteínas parcialmente desplegadas asocian Mientras forman películas
estabilizadoras.
Cuanto más rápidamente se difunde una molécula de proteína En
interfaces y más fácilmente se desnaturaliza Allí, más que es capaz de espuma.
Estas Los valores a su vez dependen de la masa molecular, Hidrofobicidad superficial
y la estabilidad de la conformación.
Las espumas se derrumban porque crecen grandes burbujas de
gas A expensas de las burbujas más pequeñas (desproporción). Las películas
proteicas contrarrestan esta Desproporción. Es por ello que la estabilidad Una
espuma depende de la fuerza de la proteína Y su permeabilidad a los gases.
Resistencia de la película Depende de la cantidad adsorbida de proteína Y la
capacidad de las moléculas adsorbidas para asociar. La desnaturalización
superficial generalmente se libera Cadenas laterales de aminoácidos adicionales
que pueden En interacciones intermoleculares. El fuerte La reticulación, la más
estable la película.
Puesto que la carga neta mínima posible Asociación, el pH
del sistema debería El rango de los puntos isoeléctricos de las proteínas Que
participan en la formación cinematográfica.
En resumen, la formación de espuma ideal y la formación de espuma
Proteína se caracteriza por una baja Peso molecular, alta hidrofobicidad
superficial, Buena solubilidad, una pequeña carga neta en términos PH del alimento,
y fácil desnaturalización.
Las espumas son destruidas por lípidos y disolventes
orgánicos Tales como alcoholes superiores, que debido a su La hidrofobicidad desplazan
las proteínas del gas Superficie de la burbuja sin poder formar Películas. Incluso
una baja concentración de Yema de huevo, por ejemplo, impide el estallido de clara
de huevo. Esto se atribuye a una perturbación de Proteína por las lecitinas.
Las características de formación de espuma y estabilización
de espuma De proteínas puede mejorarse mediante Y modificación física. Así, una
enzimática parcial La hidrólisis conduce a una reducción más Moléculas
difusoras, una mejor solubilidad y la liberación De grupos hidrófobos. Las
desventajas son La estabilidad de la película generalmente inferior y la
pérdida de Coagulabilidad térmica. Las características Ser mejorado mediante la
introducción de (Véase 1.4.6.2) y por desnaturalización térmica parcial (Por
ejemplo, proteínas de suero). Recientemente, la adición De proteínas
fuertemente alcalinas (por ejemplo, clupeínas) Está siendo probado, lo que aparentemente
aumenta la asociación De proteínas en las películas y permite Espumación de los
sistemas grasos.
1.4.3.5 Formación de
Gel
Los geles son sistemas dispersos de al menos dos componentes
En el que la fase dispersa en el dispersante Forma una red cohesiva. Se
caracterizan por Por la falta de fluidez y deformabilidad elástica.
Los geles se colocan entre soluciones, En el que las fuerzas
repulsivas entre moléculas y La fase dispersa predomina y precipita, Donde
predominan fuertes interacciones intermoleculares.
Se distingue entre dos tipos de gel, Las redes poliméricas y
las dispersiones agregadas, Aunque se encuentran formas intermedias así como.
Ejemplos de redes poliméricas son los geles Formado por
gelatina (véase 12.3.2.3.1) y polisacáridos Tales como la agarosa (véase
4.4.4.1.2) y Carragenano (4.4.4.3.2). Formación de una estructura
tridimensional Red se lleva a cabo a través de la Agregación de moléculas
fibrosas no ordenadas Vía estructuras parcialmente ordenadas, e. gramo.
mientras que el doble Se forman hélices (véase 4.4.4.3.2, figura 4.14, Higo.
12.21). La característica para los geles de este tipo es La baja concentración
de polímero (~ 1%), así como Transparencia y textura fina. La formación de gel
es Causado por el establecimiento de un cierto pH, añadiendo Iones, o por
calentamiento / enfriamiento. Dado que la agregación Se produce principalmente
a través de hidrógeno intermolecular Enlaces que se rompen fácilmente cuando se
calientan, polímeros Las redes son termo-reversibles, i. mi. El Geles se forman
cuando una solución se enfría, y Fundir de nuevo cuando se calienta.
Ejemplos de dispersiones agregadas son los Geles formados
por proteínas globulares después del calentamiento Y desnaturalización. El
despliegue térmico del Proteína conduce a la liberación del lado del aminoácido
Cadenas que pueden entrar en intermoleculares Interacciones. La asociación
posterior ocurreMientras que los pequeños agregados esféricos forman Se
combinan en hilos lineales cuya interacción Establece la red de gel. Antes de
que el gel Formado en el tipo no ordenado de agregación, Una concentración de
proteína relativamente alta (5-10%) es necesario. La tasa de agregación también
debería Más lento que el índice de despliegue, ya Se forman geles gruesos y
poco estructurados, Tal como en el área del punto isoeléctrico.
El grado de desnaturalización necesario para comenzar La
agregación parece depender de la proteína.
Dado que la desnaturalización parcial libera principalmente Hidrofóbicos,
hidrofóbicos intermoleculares Generalmente predominan los bonos, lo que El
carácter termoplástico (termo-irreversible) De este tipo de gel, en contraste
con el termorreversible Gel estabilizado por enlaces de hidrógeno.
Los geles termoplásticos no se licuan cuando se calientan, Pero
pueden suavizar o encogerse. Además de Enlaces hidrófobos, enlaces disulfuro
formados De los grupos tiol liberados también pueden Reticulación, al igual que
los enlaces iónicos intermoleculares Entre proteínas con diferentes puntos
isoeléctricos En sistemas heterogéneos (por ejemplo, clara de huevo). La
formación de gel se puede mejorar añadiendo sal.
El aumento moderado de la fuerza iónica aumenta Interacción entre
macromoléculas cargadas o Agregados moleculares a través del blindaje de carga
Sin precipitaciones. Un ejemplo Es la coagulación por calor de la cuajada de
soja (tofu, Cf. 16.3.1.2.3) que es promovido por el calcio Iones.
1.4.3.6 Efecto
emulsionante
Las emulsiones son sistemas dispersos de uno o Más líquidos
inmiscibles. Están estabilizados Por emulsionantes - compuestos que forman Películas
de interfase y evitar así la dispersión Fases de fluir juntas (véase 8.15).
Debido a su naturaleza anfipática, las proteínas Puede
estabilizar emulsiones de o / w tales como leche (Véase 10.1.2.3). Esta
propiedad se hace uso de En gran escala en la producción de alimentos preparativos.
La adsorción de una proteína en la interfase de Una gotita
de aceite es termodinámicamente favorecida Debido a que los residuos de
aminoácidos hidrófobos Puede escapar de la red de puente de hidrógeno De las
moléculas de agua circundantes. En adición, El contacto de la proteína con la
gotita de aceite resultados En el desplazamiento de las moléculas de agua Regiones
hidrofóbicas del límite petróleo-agua la que Difunde en la interfase y en la
deformabilidad De su conformación bajo la influencia De la tensión interfacial
(desnaturalización superficial).
La velocidad de difusión depende de la temperaturaY el peso
molecular, que a su vez puede Ser influenciados por el pH y la fuerza iónica.
La adsorbilidad depende de la exposición de Hidrófilos e
hidrófobos y, por lo tanto, En el perfil de aminoácidos, así como en el PH, la
resistencia iónica y la temperatura. Los Estabilidad conformativa depende del
amino La composición ácida, el peso molecular y Los enlaces disulfuro intramoleculares.
Por lo tanto, Una proteína con cualidades ideales como emulsionante Para una
emulsión de aceite en agua tendría una De bajo peso molecular, un aminoácido equilibrado
Composición ácida en términos de carga, polarmY residuos no polares, buena solubilidad
en agua, Hidrofobicidad superficial bien desarrollada, y Una conformación relativamente
estable. La β-caseína Molécula cumple estos requisitos porque Estructuras secundarias
menos pronunciadas y No hay enlaces cruzados debido a la falta de grupos SH (Véase
10.1.2.1.1). La "cola" apolar de esta flexibilidad Molécula es adsorbida
por la fase oleosa del La capa límite y la "cabeza" polar, que Proyecta
en el medio acuoso, impide fusión.
La capacidad de solubilidad y emulsión de algunos
3.2 CONFORMACION
La información sobre la conformación está disponible Mediante
el análisis cristalográfico por rayos X de Cristales de proteínas y midiendo la
distancia (\ Leq 30 nm) entre los protones seleccionados del péptido (NHi - NHi
+ 1, NHi + 1 - CαHi, NHi + 1 - CβHi, CαHi-CαHi + 1, CαHi-CβH) mediante RMN de H
Espectroscopia en solución. Esto supone que, en Muchos casos, la conformación
de la proteína en Forma cristalina es similar a la de la proteína en solución.
Como ejemplo, el electrón calculado Densidad de 2,5-dioxopiperazina Basados
en diversos grados de resolución son Presentado en la Fig. 1.14. Los átomos
individuales son Bien revelado a 0,11 nm. Tal resolución No se ha logrado con
proteínas. De confianza Localización del átomo de Cα de la cadena peptídica Requiere
una resolución de menos de 0,3 nm.
1.4.2.1 Cadenas
peptídicas extendidas
Análisis estructural de rayos X y otras medidas físicas De
una cadena de péptidos completamente extendida Las longitudes y ángulos de los
enlaces (ver la "bola Y palo "en la Fig. 1.15). El péptido Bond tiene
carácter de enlace doble parcial (40%) Con π electrones compartidos entre el C?
O ¿y C? N. La energía de resonancia es 83,6 kJ / mol:
Normalmente, el enlace tiene una configuración trans, i. mi.
El oxígeno del grupo carbonilo y el hidrógeno Del grupo NH
están en la posición trans; Una configuración cis que tiene 8 kJ mol-1 más Energía
sólo se produce en casos excepcionales (por ejemplo, en Pequeños péptidos
cíclicos o en proteínas antes de prolina Residuos).
Así, en la ribonucleasa A, dos enlaces X-Pro Tienen trans-conformación
(Pro-42 y Pro- 117), y dos tienen conformación cis (Pro-93 Y Pro - 114). El
equilibrio entre el Dos isómeros son catalizados por enzimas específicas (Peptidil-prolil-cis
/ trans-isomerasas).
Esto acelera el plegado de un péptido (Véase 1.4.2.3.2), que
en términos de La biosíntesis se produce inicialmente en toda
transconformación. Seis átomos de los enlaces peptídicos, Cαi , C \ I, Oi, Ni +
1, Cα i + 1 y Hi + 1, se encuentran en un plano (véase la figura 1.16).
Para un enlace trans-péptido, ωi es 180◦. La posición De dos
planos vecinos está determinada por la Valor numérico de los ángulos ψi (enlace
de rotación Entre un carbono carbonilo y un carbono α) y Φi (enlace de rotación
entre una amida-N y una Α-carbono). Para una cadena peptídica extendida, ψi = 180◦
y φi = 180◦. La posición de cadenas laterales También puede describirse por una
serie de ángulos χ1-n yo .
1.4.2.2 Estructura
secundaria
(Elementos estructurales regulares) La estructura primaria
da la secuencia de Aminoácidos en una cadena proteica mientras que la
secundaria Estructura revela la disposición de los Cadena en el espacio. Las
cadenas peptídicas no están Una forma extendida o desplegada (ψi, φi = 180◦).
Se puede demostrar con modelos que ψi y φi, A una distancia
mínima permisible entre Átomos que no se unen (Tabla 1.20), puede asumir Sólo
ángulos particulares. La figura 1.17 presenta la Tolerables para los
aminoácidos distintos de los Glicina (R = H). El rango es más amplio para la
glicina (R = H). La Figura 1.18 demuestra que la mayoría De 13 proteínas
diferentes con un total de aproximadamente Se han mostrado 2500 residuos de
aminoácidos Empíricamente para tener valores de pares ψ, φ dentro deEl rango permitido.
Cuando una multitud de Igual ψ, φ-pares se produce consecutivamente en un
péptido Cadena, la cadena adquiere una estructura estructural elementos. Los tipos
de elementos estructurales Se recopilan en la Tabla 1.21.
1.4.2.2.1 \ beta –
Hoja
Tres elementos
estructurales regulares (hoja plisada Estructuras) tienen valores en el rango
de Φ = -120 ◦C y ψ = +120 ◦C. El péptido Cadena siempre se pliega ligeramente
sobre el átomo de Cα (Véase la figura 1.19), por lo que las cadenas laterales R
se extienden Perpendicularmente al eje de extensión de la cadena, yo. mi. Las
cadenas laterales cambian alternativamente sus proyecciones De + z a -z. Tal
estructura plisada es Estabilizado cuando más cadenas están presentes. Posteriormente,
las cadenas adyacentes interactúan Eje x por enlace de hidrógeno,
proporcionando así el Reticulación necesaria para la estabilidad. Cuando está
adyacente Las cadenas funcionan en la misma dirección, el péptido Las cadenas
son paralelas. Esto proporciona un estabilizado, Planar, estructura de hoja
paralela. Cuando las cadenas En direcciones opuestas, un plano, antiparalelo La
estructura de la hoja está estabilizada (Fig. 1.20). los Energía libre más
baja, estructuras de chapa Que los ejes principales de las cadenas vecinas Están
dispuestos en un ángulo de 25 ° C (Fig. 1.21), son Más comunes que las
estructuras planas de hojas.
Las estructuras β también pueden considerarse como Hélice
con una continuación de 2 residuos por vuelta. Con la prolina, la formación de
una estructura β no es posible.
1.4.2.2.2 Estructuras
Helicoidales
Hay tres elementos estructurales regulares en la Rango de φ
= -60◦ y ψ = -60◦ (véase la figura 1.17) En el que las cadenas peptídicas están
enrolladas como Un tornillo roscado. Estas estructuras se estabilizan Por
puentes de hidrógeno intracadena que se extienden Casi paralelo al eje de la
hélice, la reticulación Los grupos CO y NH, i. E., El grupo CO Del residuo aminoácido
i con el grupo NH de Residuo i + 3 (310 hélices), 1 + 4 (hélice α) o i + 5 (\
Pi - hélice).
La estructura más común es la α-hélice y para Polipéptidos
de L-aminoácidos, exclusivamente el La hélice α derecha (Fig. 1.22). El zurdo Α-hélice
es enérgicamente desfavorable para L-amino Ácidos, ya que las cadenas laterales
aquí están en estrecha Contacto con la columna vertebral. No es posible la
α-hélice Con prolina. La hélice 310 se observó sólo en Los extremos de las
α-hélices pero no como una Estructura regular. La hélice π es hipotética.
Se conocen dos conformaciones helicoidales de Poliprolina (I
y II). Polyproline I contiene Sólo enlaces cispeptidos y es diestro, mientras
que La poliprolina II contiene enlaces trans-péptido Y es zurdo. La estabilidad
de los dos Depende del disolvente y de otros Factores. En el agua predomina la
poliprolina II.
La poliglicina también puede ocurrir en dos conformaciones.
La poliglicina I es una estructura β, mientras que la poliglicina
II Corresponde en gran parte a la hélice de poliprolina II.
Una hélice se caracteriza por los ángulos φ y ψ, O por los
parámetros derivados de estos ángulos: N, el número de residuos de aminoácidos
por vuelta; D, el aumento a lo largo del eje principal por aminoácido residuo;
Y r, el radio de la hélice. Así, La ecuación para el tono, p, es p = n · d. los
Los parámetros nyd se presentan dentro de un φ, ψ Gráfico en la Fig. 1.23.
1.4.2.2.3 Vueltas
inversas
Una característica conformacional importante de globular Las
proteínas son las vueltas inversas β-vueltas y β-curvas.
Se producen en las esquinas de "horquilla", donde
el La cadena peptídica cambia de dirección abruptamente. Tal Las esquinas
envuelven cuatro residuos de aminoácidos a menudo Incluyendo prolina y glicina.
Varios tipos de Se conocen las vueltas; De mayor importancia son el tipo I (42%
de los 421 turnos examinados), tipo II (15%) y Tipo III (18%); Véase la fig.
1.24.
En el tipo I, se permiten todos los residuos de aminoácidos,
Con la excepción de la prolina en Posición 3. En el tipo II, se requiere
glicina En la posición 3. En el tipo III, que corresponde A una hélice 310,
todos los aminoácidos son permitido. Las secuencias de las β-curvas De lisozima
se enumeran en la Tabla 1.22 como ejemplo.
1.4.2.2.4 Estructuras
Super-Secundarias
El análisis de estructuras proteicas conocidas ha Demostrado
que los elementos regulares pueden existir en Formas combinadas. Los ejemplos
son la bobina en espiral Α-hélice (figura 1.25, a), segmentos de cadena con Estructuras
β antiparalelas (estructura β-meandro; Higo. 1,25, b) y combinaciones de
α-hélice y Estructura β (por ejemplo, βαβαβ, figura 1.25 c).
1.4.2.3 Estructuras
terciarias y cuaternarias
Las proteínas se pueden dividir en dos grupos grandes La
base de conformación: (a) fibrilar (fibroso) O escleroproteínas, y (b)
proteínas dobladas o globulares.
1.4.2.3.1 Proteínas
fibrosas
La cadena peptídica completa está empaquetada o dispuesta Dentro
de una misma estructura regular para una Proteínas fibrosas. Son ejemplos la
queratina de lana (α- Hélice), fibroína de seda (estructura de hoja β) y
colágeno (Una triple hélice). Estabilización de estas estructuras Se logra
mediante unión intermolecular (electrostática Interacción y enlaces disulfuro,
pero Principalmente enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas).
1.4.2.3.2 Proteínas
globulares
Los elementos estructurales regulares se mezclan
aleatoriamente Segmentos de cadena extendidos (aleatoriamente Estructuras) en
las proteínas globulares. La proporción de Elementos estructurales regulares es
muy variable: 20- 30% en caseína, 45% en lisozima y 75% en mioglobina (Tabla
1.23). Cinco subgrupos estructurales son Conocido en este grupo de proteínas:
(1) α-hélices Ocurren solamente; (2) sólo se producen estructuras β; (3) \
alpha - Partes helicoidales y β-estructurales se producen en Segmentos en la
cadena peptídica; (4) \ alpha - hélice y Las estructuras β se alternan a lo largo
de la cadena peptídica; y (5) α-hélice y β-estructuras no existen.
El proceso de plegado de cadena peptídica aún no entendido
completamente. Comienza espontáneamente, probablemente Procedentes de un centro
o de varios centros De alta estabilidad en proteínas más grandes. La tendencia Para
formar elementos estructurales regulares muestra Un desarrollo muy diferente en
los diversos aminoácidos Residuos de ácido. La Tabla 1.24 enumera los datos Derivados
del análisis de proteínas globulares de Conocida. Los datos indican, por
ejemplo, Que Met, Glu, Leu y Ala están fuertemente Formación de hélices. Gly y
Pro por otro lado Muestran una fuerte tendencia a romper la hélice. Val, Ile Y
Leu promueven la formación de láminas plisadasEstructuras, mientras que Asp,
Glu y Pro les impiden.
Pro y Gly son bloques de construcción importantes Vueltas La
arginina no prefiere ninguno de los tres Estructuras. Mediante dichos datos es
posible Pronosticar las conformaciones esperadas para un Secuencia de
aminoácidos.
El plegado de la cadena peptídica lo acumula densamente Por
la formación de un gran número de moléculas intermoleculares Enlaces no
covalentes. Los datos sobre la Los bonos involucrados se proporcionan en la
Tabla 1.25.
Los enlaces H formados entre las cadenas principales, Y las
cadenas laterales y las cadenas laterales son particularmente Importancia para el
plegado. La porción de polar Grupos involucrados en la acumulación de enlaces-H
en proteínas De Mr> 8.9 kdal parece ser bastante constante en alrededor de
50%.
La interacción hidrófoba de las regiones no polares De las
cadenas de péptidos también juega un papel importante Papel en el plegamiento
de proteínas. Estas interacciones son Responsables de que los grupos no polares
Plegado en gran medida hacia el interior de la Glóbulo de proteína. Las
superficies accesibles para Las moléculas de agua se han calculado tanto para
las Y formas plegadas nativas para una serie de Monoméricas con conformaciones
conocidas.
La proporción de la superficie accesible en la Estado
estirado, que tiende a ser enterrado en el interior Del glóbulo como resultado
del plegado, es un simple Función lineal del peso molecular (M).
La ganancia en energía libre para la superficie plegada es 10
kJnm - 2. Por lo tanto, la contribución hidrofóbica total Para liberar energía
debido al plegado es:
Esta relación es válida para un rango de 6108 ≤ M ≤ 34,409, pero
también parece válido para Moléculas ya que a menudo consisten en varios Asociaciones
holgadas de globulares globulares Porciones llamadas dominios estructurales
(Fig. 1.26).
Las proteínas con enlaces disulfuro se pliegan
significativamente Menor velocidad que aquellos sin disulfuro cautiverio. El
plegado no está limitado por la reacción Tasa de formación de disulfuro. Por lo
tanto, el plegado Proceso de proteínas que contienen disulfuro parece Proceder
de una manera diferente. El proceso inverso, Despliegue de proteínas, es muy
lento Por la presencia de puentes disulfuro que Generalmente proporcionan una
gran estabilidad a Proteínas. Esta estabilidad es particularmente efectiva Contra
la desnaturalización. Un ejemplo es el Inhibidor Bowman-Birk de la soja (Fig.
1.27) Que inhibe la actividad de tripsina y quimotripsina.
Su estructura terciaria está estabilizada Por siete puentes
disulfuro. Los sitios reactivos De inhibición son Lys16 - Ser17 y Leu43 -
Ser44, yo. mi. Ambos sitios están ubicados en áreas relativamente pequeñas Anillos,
cada uno de los cuales consiste en nueve amino Residuos de ácido mantenidos en
forma de anillo por un disulfuro puente. La estabilidad térmica de este
inhibidor es alto.
Como ejemplos del plegamiento de proteínas globulares, Higo.
1.28 muestra esquemáticamente el curso de la Cadenas peptídicas en la cadena β
de la hemoglobina, en Triosafosfato isomerasa y carboxipeptidasa.
Otras conformaciones de proteínas se muestran en los
siguientes cifras:
- Higo. 8.7 (véase 8.8.4): Taumatina y monelina (bidimensional)
- Higo. 8,8 (ver 8.8.5): Taumatina y monelina (tridimensional)
- Higo. 11.3 (véase 11.2.3.1.4): Lisozima
1.4.2.3.3 EEB
El origen de las encefalopatías espongiformes transmisibles (TESs)
se explica por un cambio En la conformación proteica. (El nombre se refiere a Las
deformaciones esponjosas que ocurren en el cerebro En esta enfermedad. Los
defectos resultantes interrumpen La transmisión de señales). Uno de los TESs Es
la encefalopatía espongiforme bovina (EEB).
De acuerdo con la hipótesis actual, las TES son Causada por
proteínas priónicas patógenas (PrPp), Que pueden estar presentes en la harina
animal utilizada Como pienso. PrPp se forman a partir de prión normal Proteínas
(PrPn) se encuentran en todas las células de mamíferos Sin embargo, una PrPp
obliga a la conformación patogénica En un PrPn. La estabilidad hacia la serina Proteinasa
K del hongo Tritirachium Álbum se utiliza para diferenciar entre PrPp Y PrPn.
Serina proteinasa K, que ataca El lado carboxilo de aminoácidos hidrófobos, Hidroliza
en gran medida PrPn mientras que una característica Péptido (Mr 27 - 30 kDa) se
libera de PrPp. Este marcador se puede identificar usando el sándwich ELISA
(véase 2.6.3).
1.4.2.3.4 Estructuras
cuaternarias
Además de la ganancia de energía libre por plegado De una
sola cadena peptídica, asociación de más Que una cadena peptídica (subunidad)
puede proporcionar Ganancias adicionales en energía libre. Por ejemplo, Hemoglobina
(4 cadenas peptídicas asociadas) \ Alpha _ {G} = -46 kJ molar - 1 y la tripsina
– tripsina Inhibidor (asociación de 2 péptidos Cadenas G _ {0} = -75,2 kJ
mol-1. En principio Tales asociaciones corresponden al plegado de Una cadena
peptídica más grande con varias estructurasSin unirse covalentemente a las
subunidades. La Tabla 1.26 enumera algunas proteínas que parcialmente Exhiben
estructuras cuaternarias.
1.4.2.4
Desnaturalización
El término desnaturalización denota un efecto reversible o
irreversible Cambio de conformación nativa (terciario Estructura) sin escisión
de enlaces covalentes (excepto Para puentes disulfuro). La desnaturalización es
posible Con cualquier tratamiento que escinda hidrógeno Puentes, enlaces iónicos
o hidrófobos. Esto puede ser Logrado por: cambiar la temperatura, ajustar El
pH, aumentando el área de la interfaz, o Añadiendo disolventes orgánicos,
sales, urea, clorhidrato de guanidina O detergentes tales como sodio dodecilo sulfato.
La desnaturalización es generalmente reversible cuando La cadena peptídica se
estabiliza en su estado desplegado Por el agente desnaturalizante y la
conformación nativa Puede restablecerse después de retirar el agente. La
desnaturalización irreversible ocurre cuando la La cadena peptídica desplegada
se estabiliza mediante la interacción Con otras cadenas (como ocurre por
ejemplo con el huevo Proteínas durante la ebullición). Durante el despliegue
reactivo Grupos, como los grupos tiol, que fueron enterrados O bloqueados,
pueden estar expuestos. Su participación En la formación de enlaces disulfuro
también puede Una desnaturalización irreversible.
Una agregación de las cadenas peptídicas causada por El
plegamiento de proteínas globulares está conectado con Reducida solubilidad o
hinchabilidad. Así, la parte De gluten de trigo que es soluble en ácido acético
disminuye A medida que aumenta el estrés térmico (Fig. 1.29). Como Un resultado
de la reducción de la capacidad de aumento de gluten Causado por el pretratamiento,
el volumen de pan Hecha de harinas recombinadas es más pequeña (Fig. 1.30).
En el caso de las proteínas fibrosas, la desnaturalización, Mediante
la destrucción de la estructura altamente ordenada, Generalmente conduce a una
mayor solubilidad o Aumento de la capacidad. Un ejemplo es el La conversión de
colágeno a gelatina, que Ocurre cuando la carne se cocina (véase 12.3.2.3.1).
La desnaturalización térmica de las proteínas del suero Β-lactoglobulina
y α-lactalbúmina ha sido bien estudiada.
Los datos de la Tabla 1.27 basados en la reacción Cinética
y el diagrama de Arrhenius (Fig. 1.31) Indican que la energía de activación del
conjunto Reacción en el rango de 80-90 ◦C cambios. Los Mayores valores de Ea a
temperaturas más bajas deben Atribuido al plegado, que es la reacción parcial Que
determina la velocidad de reacción a las temperaturas <90 ◦C. A temperaturas
más altas (> 95 ◦C), La agregación a la que la menor energía de activación Corresponde
predomina.
Los valores en la Tabla 1.27 determinados para la activación
Entropía también apoyan el atribución. En el rango de temperatura de 70-90 ◦C, ?
S # es siempre positivo, lo que indica un estado De mayor desorden de lo
esperado Con el predominio de la reacción de plegado.
Por otro lado, los valores negativos? S # en 95-105 ◦C indica
un estado de mayor orden que Debería esperarse teniendo en cuenta que la
agregación Predomina en este rango de temperatura. Detallado Estudios del tipo
descrito anteriormente permiten una Control de procesos térmicos. En el caso de
El procesamiento de la leche, los datos han hecho posible, Por ejemplo, para
evitar la separación del suero Proteínas en los equipos de calefacción y
optimizar Las propiedades de los geles de yogur (véase 10.1.3.3 Y 10.2.1.2).
La figura 1.32 muestra la desnaturalización de β-LG En un
diagrama que combina el período de calentamiento Con la temperatura (véase
2.5.4.3) en la Forma de líneas rectas de igual desnaturalización Grados Esto nos
permite leer directamente el Combinaciones tiempo / temperatura necesarias para
Un cierto efecto deseado. A 85 ◦ C / 136 s para Por ejemplo, sólo el 60% de los
β-LG-B se pliegan, De modo que sólo el 60% puede agregarse, aunque el 90% Potencialmente
capaz de agregar: en este La temperatura, el plegado determina la Reacción,
como se muestra anteriormente. Por el contrario, el 90% de La proteína se
pliega potencialmente a 95 ° C / 21 s Mientras que sólo el 60% puede ser
agregado. en este Temperatura, la agregación determina la reacción.
La desnaturalización de proteínas biológicamente activas Generalmente
asociados con la pérdida de actividad. El hecho Que las proteínas desnaturalizadas
se digieren más fácilmente Por enzimas proteolíticas es también de interés.
3.1 SECUENCIA DE AMINOACIDOS
1.4.1.1 Composición
de aminoácidos, subunidades
El análisis secuencial sólo puede realizarse Una proteína
pura. En primer lugar, la composición de aminoácidos Se determina después de la
hidrólisis ácida.
El procedimiento (separación en un único intercambio catiónico
Columna de resina y desarrollo de color Con reactivo de ninhidrina o
fluorescamina) tiene Han sido normalizados y automatizados (aminoácido Analizadores).
La figura 1.10 muestra un aminoácido típico Cromatograma ácido.
Como alternativa a estos métodos establecidos, La
derivatización de los aminoácidos con la posterior Separación y detección de
derivados Es posible (derivatización pre-columna). Varios Se pueden seleccionar
reactivos de derivatización, tales como:
• 9 - Fluorenilmetilcloroformiato(FMOC, véase 1.2.4.2.1)
• Fenilisotiocianato (PITC, véase 1.2.4.2.3)
• Dimetilaminoazobencenosulfonilcloruro (DABS-Cl, véase
1.2.4.2.1)
• Dimetilaminonaftalensulfonilcloruro (DANS-Cl, véase
1.2.4.2.1)
• 7 - Fluoro - 4 - nitrobenzo - 2 - oxa - 1,3 – diazole (NBDF,
véase 1.2.4.2.1)
• 7 - Cloro - 4 - nitrobenzo - 2 - oxa - 1,3 – diazol (NBDCl,
véase 1.2.4.2.1)
• o-ftaldialdehído (OPA, véase 1.2.4.2.4)
También es necesario conocer el peso molecular De la
proteína. Esto se determina por la columna de gel Cromatografía, ultracentrifugación o SDSPAG Electroforesis.
Además, es necesario Para determinar si la proteína es una sola Molécula o
consta de un número de moléculas idénticas o Diferentes cadenas polipeptídicas
(subunidades) asociadas A través de enlaces disulfuro o fuerzas no covalentes.
La disociación en subunidades puede lograrse Por un cambio
en el pH, por modificación química de La proteína, tal como por succinilación,
o con desnaturalización Agentes (urea, clorhidrato de guanidina, dodecil
sulfato de sodio). Los enlaces disulfuro, que También se encuentran en
proteínas que consisten Una cadena peptídica, se puede escindir por oxidación
de Cistina a ácido cisteico o por reducción a cisteína Con posterior
alquilación del grupo tiol (Véase 1.2.4.3.5) para evitar la reoxidación.
Separación De las subunidades se logra por cromatografía o Métodos
electroforéticos.
1.4.1.2 Grupos
terminales
Los aminoácidos N-terminales pueden determinarse Por
tratamiento de una proteína con l-fluoro-2,4- Dinitrobenceno (reactivo de Sanger,
véase 1.2.4.2.2) o 5 - dimetilaminonaftaleno - 1 – sulfonilo (Cloruro de
dansilo, véase 1.2.4.2.1). Otra posibilidad Es la reacción con cianato, seguida
por Eliminación del aminoácido N-terminal en el Forma de hidantoína, y
separación y recuperación Del aminoácido por escisión de la hidantoína (Véase
1.2.4.2.3). El aminoácido N - terminal (y La secuencia de aminoácidos próxima a
la N-terminal) Es accesible por hidrólisis con aminopeptidasa, En cuyo caso
debe recordarse que La tasa de hidrólisis depende del aminoácido Cadenas
laterales y que los residuos de prolina no Escindido Se requiere un
procedimiento especial El residuo N-terminal es acilado (N-formil- o N-acetilaminoácidos,
o ácido piroglutámico).
La determinación de aminoácidos C-terminales es Posible
mediante el procedimiento de hidrazinolisis Recomendado por Akabori:
El aminoácido C-terminal se separa luego de Las hidrazidas
de aminoácidos, e. G, mediante un intercambio de cationes Resina, e
identificado. Es posible marcar El aminoácido C-terminal a través de la
titulación selectiva vía oxazolinona Los aminoácidos C-terminales pueden ser
eliminados Enzimáticamente por la carboxipeptidasa A que Preferentemente
escinde los aminoácidos con aromáticos Y grandes cadenas laterales alifáticas,
carboxipeptidasa B, que cliva preferentemente la lisina, Arginina y aminoácidos
con cadenas laterales neutras O carboxipeptidasa C que escinde con menos Especificidad
pero escinde la prolina.
1.4.1.3 Hidrólisis
parcial
Las cadenas peptídicas más largas suelen estar fragmentadas.
Los fragmentos se separan y analizan Individualmente para
secuencias de aminoácidos. Selectivo Clivaje enzimático de los enlaces
peptídicos Principalmente con tripsina, que Cliva exclusivamente los enlaces Lys-X-
y Arg-X, Y quimotripsina, que escinde enlaces peptídicos Con menos especificidad
(Tyr-X, Phe-X, Trp-X y Leu - X). El ataque enzimático puede ser influenciado Por
modificación de la proteína. Por ejemplo, Acilación del grupo ε-amino de los
límites de lisina Hidrólisis tríptica a Arg-X (véase 1.4.4.1.3 Y 1.4.4.1.4),
mientras que la sustitución del grupo SH De un residuo de cisteína con un
aminoetilo Grupo introduce una nueva posición de división Para la tripsina en
la molécula "pseudolysine residuo"):
También adecuado para la hidrólisis enzimática específica De
las cadenas peptídicas es la endoproteinasa Glu-C De Staphylococcus aureus V8.
Cierra Glu- X (tampón de carbonato de amonio pH 7,8 o Tampón de acetato de
amonio pH 4,0) así como Glu - X más enlaces Asp - X (tampón fosfato pH 7,8).
El método químico más importante para la Clivaje utiliza bromuro
de cianógeno (BrCN) para Ataque Met-X-enlaces (Reacción 1.86).
La hidrólisis de proteínas con ácidos fuertes revela Una
diferencia en las tasas de hidrólisis del péptido Enlaces dependiendo del lado
de aminoácido adyacente cadena. Bonos que implican grupos amino de serina Y
treonina son particularmente susceptibles a la hidrólisis.
Este efecto se debe a N → O-acilo a través de la oxazolina y
posterior Hidrólisis de la unión éster:
La hidrólisis de proteínas con ácidos diluidos
preferentemente Rompe los enlaces aspartil-X La separación de fragmentos
peptídicos se logra mediante Gel y cromatografía en columna de intercambio
iónico Utilizando un tampón volátil como eluyente (piridina, Acetato de morfolina)
que se puede eliminar Por liofilización de las fracciones recogidas.
La separación de péptidos y proteínas por La HPLC de fase
inversa ha adquirido gran importancia, Utilizando tampones volátiles mezclados
con Disolventes orgánicos solubles en agua como fase.
La fragmentación de la proteína se realiza mediante Diferentes
técnicas enzimáticas y / o químicas, Al menos por dos enzimas de diferente
especificidad.
La disposición de los péptidos obtenidos en la Mismo orden
que ocurren en la proteína intacta Se realiza con la ayuda de la superposición Secuencias.
El principio de este método es Ilustrado para la subtilisina BPN? Como ejemplo
en Higo. 1.11.
1.4.1.4 Análisis secuencial
El método clásico es la degradación de Edman reacción.
Implica degradación escalonada de Péptidos con fenilisotiocianato (véase
1.2.4.2.3) O derivados adecuados, e. gramo. Dimetilaminoazobenceno
Isotiocianato (DABITC). Los La feniltiohidantoína resultante se identifica Directamente
o se recupera el aminoácido.
Las reacciones escalonadas se realizan en solución O en el
péptido unido a un vehículo, i. mi.
A una fase sólida. Ambos enfoques han sido Automatizada (
"secuenciador"). Los transportistas utilizados incluyen Resinas que
contienen grupos amino (por ejemplo amino Poliestireno) o perlas de vidrio
tratadas con amino alquilsiloxano:
Los péptidos se fijan entonces al soporte por Grupos carboxilo
(activación con carbodiimida O carbonildiimidazol, como en la síntesis de
péptidos) O por grupos amino. Por ejemplo, un péptido Segmento de la hidrólisis
de la proteína por La tripsina tiene lisina como su aminoácido C-terminal. Se
une al portador con p-fenilendiisotiocianato A través de la α- y ε-amino
Grupos. Tratamiento ácido suave del portador Bajo las
condiciones de la degradación de Edman se divide El primer enlace peptídico. El
procedimiento de Edman Se realiza entonces sobre el péptido acortado A través
de la segunda, tercera y posterior repetitiva reacciones:
Las microvariedades permiten trabajar en el picomole distancia.
En la cámara de reacción, la proteína Está fijado sobre un disco de fibra de
vidrio, y el acoplamiento Y se añaden reactivos de escisión y Eliminado en una
corriente de gas portador (fase vapor Secuenciación).
Aparte de la degradación de Edman, otros Métodos pueden dar
valiosa información adicional En el análisis de secuencias. Estos métodos Incluyen
la hidrólisis con amino- y carboxipeptidasas Como se menciona en el caso de Análisis
de grupo final y la fragmentación de Derivados de péptidos volátiles adecuados
en una masa espectrómetro.
1.4.1.5 Derivación de
la secuencia de aminoácidos
De la Secuencia de Nucleótidos Del gen de codificación El
número de proteínas para las que el gen codificador En el genoma se ha caracterizado
se está incrementando continuamente. Sin embargo, una parte Secuencias de aminoácidos
conocidas hoy en día Derivado de las secuencias de nucleótidos en pregunta.
Los antecedentes de este proceso serán brevemente Descrito
aquí. Los nucleótidos consisten en cuatro Diferentes bases así como
2-desoxirribosa y fosfórica ácido. Son los bloques de construcción de la Ácido
desoxirribonucleico de alto peso molecular (ADN).
Los nucleótidos están unidos mediante 2-desoxirribosa y Ácido
fosfórico como 3 \ → 5 \ beta - diésteres. En el ADN, dos Polinucleótidos están
unidos entre sí en cada Vía enlaces de puente de hidrógeno para dar una hélice.
Las bases timina y adenina, así como Citosina y guanina son complementarias
(véase Fórmula 1,90). El ADN es el portador de la genética Información que
controla la biosíntesis de proteínas Vía transcripción a mensajero ribonucleico
Ácido (ARN). En la traducción a proteínas, la Secuencia de bases codifica la
secuencia primaria de aminoácidos. Aquí, tres de las cuatro bases adenina, Guanina,
citosina y timina (abreviado AGCT) determina en cada caso un aminoácido, mi.
G., Códigos UGG para el triptófano (véase la figura 1.12).
Por lo tanto, la secuencia primaria de una proteína puede Derivar
de la secuencia de nucleótidos (base).
Para la secuenciación del ADN, el método deElección es el
proceso didesoxi (terminación de cadena Proceso) introducido por Fred Sanger En
1975. El principio se basa en las Terminación de la síntesis enzimática de una Hilo
de ADN mediante ADN polimerasa Usando un 2 \ beta, 3 \ beta -
didesoxinucleótido, i. E Prevenir la polimerización con la formación De los 3?
→ 5 \ alpha - fosfodiéster en la posición De la base en cuestión. Por ejemplo,
si la Se usa 2 \ beta, 3 \ beta - didesoxinucleótido de guanina, La biosíntesis
se detiene en guanina en cada caso. Para detectar todos los residuos de
guanina, Aproximadamente 0,5% en moles del didesoxinucleótido en Cuestión (basada
en el 2-desoxinucleótido) es usado. De esta manera, fragmentos de ADN de Se
obtienen longitudes que tienen el mismo 5 \ beta - terminal y así marcar la
posición de la base.
El material de partida es un híbrido de los singlestranded
ADN a secuenciar y un cebador Consistente en aproximadamente 20 nucleótidos.
Esto es Alargado con la ayuda de ADN polimerasa Y una mezcla de los 4
nucleótidos y una 2 \ beta, 3 \ beta - didesoxinucleótido en cada caso. el
cebador Sirve como posición de partida definida y también como Iniciador para
el inicio de la síntesis de los complementarios Cadena de ADN. Los fragmentos
de ADN de Diferentes longitudes obtenidas en cuatro experi- Separadas
electroforéticamente de acuerdo con Tamaño molecular. Para la detección, ya sea
el primer Puede ser etiquetado con cuatro fluorescentes diferentes Colorantes
(TAG) o los cuatro didesoxinucleótidos son Marcados con diferentes colorantes
fluorescentes. en el En el primer caso, se llevan a cabo 4 series de
experimentos Con cebadores etiquetados de forma diferente y uno De los 4 didesoxinucleótidos
en cada caso. Los Las cargas son combinadas y electroforéticamente Separadas
entre sí. La secuencia primaria se determina A partir de las señales medidas en
diferentes Longitudes de onda (Fig. 1.13). Cuando 4 diferente Se utilizan
dideoxinucleótidos marcados, el cebador No está etiquetado. Alternativamente,
los didesoxinucleótidos También puede ser marcado radioactivamente (Por
ejemplo, con 32P). En este caso, cuatro También se requieren síntesis.
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